剩余污泥厭氧(Oxygen)消化的效率在很大程度上取決于厭氧微生物種群多樣性及優(yōu)勢種群的活性[10,11].不同條件下厭氧消化運行的穩(wěn)定性及效率與系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)的變遷會存在一定的關(guān)聯(lián).厭氧污泥中主要存在水解發(fā)酵菌、 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、 產(chǎn)甲烷菌及硫（化學(xué)符號：S）酸鹽還原菌[12].其中產(chǎn)甲烷菌屬于典型的古細菌，大致可以分為兩類：一類主要利用乙酸產(chǎn)生甲烷，主要有產(chǎn)甲烷八疊球菌和產(chǎn)甲烷髦毛菌; 另一類利用氫和二氧化碳合成甲烷.由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、 鑒定的局限性，近年來研究人員嘗試應(yīng)用基于16S rRNA的分子生物學(xué)技術(shù)對厭氧污泥系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)的變化進行分析.其中末端限制性片段多態(tài)性根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物片斷的大小不同以及標(biāo)記片斷種類和數(shù)量的不同來分析群落的結(jié)構(gòu)及組成. Collins等[13]利用T-RFLP技術(shù)對接種污泥和接種后的污泥中微生物菌群變化進行研究后發(fā)現(xiàn)接種污泥中占優(yōu)勢的產(chǎn)甲烷菌群是Methanosarcinale
S、 Methanobacteria和Proteobacteria，而反應(yīng)器運行穩(wěn)定后占優(yōu)勢的菌群為Methanosarcina vacuolata和Methanobacterium palustre.T-RFLP技術(shù)可以很靈敏地檢測微生物種類的微小變化，能夠提供微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量動態(tài)變化的信息，已成功應(yīng)用于厭氧污泥產(chǎn)CH4菌的群落結(jié)構(gòu)、 動態(tài)變化的檢測等方面[14].
本研究采用剩余污泥厭氧消化產(chǎn)CH4生成勢的測試方法[15, 16]，對兩廠的剩余污泥厭氧消化進行了批次實驗，在兩廠剩余污泥的產(chǎn)的產(chǎn)CH4速率、 基質(zhì)濃度回歸的基礎(chǔ)上得出產(chǎn)CH4的關(guān)鍵參數(shù)，評價不同剩余污泥在厭氧消化過程中的產(chǎn)CH4生成勢; 同時對BMP實驗前后的水質(zhì)變化進行分析，結(jié)合厭氧消化前后T-RFLP的變化，對兩種剩余污泥在厭氧消化過程中CH4生成勢的差異進行解析[17].一方面可對不同剩余污泥厭氧消化過程中的產(chǎn)CH4潛能(Potential)進行評價，同時也能為厭氧消化工藝中微生物菌群動態(tài)變化跟蹤及關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化提供依據(jù).
1 材料與方法
1.1 厭氧污泥來源與特征
本研究所用的剩余污泥、 厭氧污泥分別來自于AP和DH污水處理廠，AP污水處理廠采用合流制明渠排水溝進水，進水水質(zhì)易受降雨影響，且泥沙等無機顆粒含量較高; DH污水處理廠配套管網(wǎng)設(shè)施完善，進水為完整的下水管網(wǎng)收集的城市生活污水.污水廠長期的監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，AP厭氧污泥的VSS/TSS值多在0.5以下，而DH厭氧污泥的VSS/TSS值維持在0.6以上，厭氧消化池代謝活性較好.AP剩余污泥的VSS為8 050 mg ?L-1，TSS為14 350 mg ?L-1.DH剩余污泥的VSS為9 250 mg ?L-1，TSS為13 230 mg ?L-
1. 1.2 BMP實驗設(shè)計
AP-BM
P、 DH-BMP共設(shè)置6組不同的污泥負荷F/M進行實驗，由于污泥濃縮的不均衡性，實測F/M如表1所示.BMP實驗在120 mL的血清瓶中進行，依據(jù)測試基質(zhì)濃度加入定量剩余污泥.采用Owen等[15]提出的厭氧微量元素溶液配方，其中CaCl2 ?2H2
O、 NH4C
L、 MgCl2 ?6H2
O、 KC
L、 MnCl2 ?4H2
O、 CoCl2 ?6H2
O、 H3BO3、 CuCl2 ?2H2
O、 Na2MoO4 ?2H2
O、 ZnCl2的濃度分別為16.7、 26.6、 120、 86.7、 1.33、
2、 0.38、 0.18、 0.17、 0.14 g ?L-1.每個血清瓶加入27 mL的微量元素液體和5.4 mL的2HPO4，之后依據(jù)不同的F/M比值接種厭氧污泥、 剩余污泥后，蓋上膠蓋并用鋁箔封口.在35℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱內(nèi)進行實驗，實驗過程(guò chéng)中以玻璃注射筒測量總產(chǎn)氣量，并利用GC-ECD測定CH4、 CO2和H2的比例.共設(shè)置兩組平行實驗，取均值進行產(chǎn)氣量、 水質(zhì)分析. AP-BM
P、 DH-BMP分別設(shè)置兩組平行實驗，產(chǎn)氣量測量可精確到0.1 mL.
表 1 BMP實驗實測F/M比
1.3 分析方法
1.3.1 常規(guī)指標(biāo)
常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)，包括p
H、 TS
S、 NH+4-
N、 TK
N、 COD等，均依照美國EPA規(guī)定的Standard Methods[18]規(guī)定進行.實驗過程中氣體成分的測量采用氣相色譜進行.
1.3.2 T-RFLP分析
圖1 實測CH4累積產(chǎn)氣量與回歸曲線
本研究參照了Lueders等[19]建立的T-RFLP方法對實驗前后厭氧污泥的生物多樣性進行分析，實驗步驟如下：
①通過PCR來復(fù)制DNA樣品中的目標(biāo)基因，引物為在5′的尾端上帶有熒光的Ar 109f和Ar 912r*，首先在94℃預(yù)變性5 min，擴增循環(huán)階段包括94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共循環(huán)28 cycles，最后在72℃條件下延伸6 min.
②在8.5 μL的PCR產(chǎn)物中加入0.5 μL TaqⅠ和1.5 μL的緩沖溶液，在65℃條件下消化切割2 h;
③將切割后的片段利用電泳分離并以熒光偵測器檢測片段上所帶的熒光強度. Lueders等[19]成功分離、 克隆出產(chǎn)CH4髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)CH4微菌Methanomicrobiacea
E、 RC-I和產(chǎn)CH4桿菌Methanobacteriaceae，未能定性的菌種歸入Diverse類.
1.3.3 數(shù)據(jù)分析
剩余污泥厭氧消化過過程中累積CH4產(chǎn)氣量采用改進的Gompertz模型回歸分析(Analyse)[20]
式中，y為累積產(chǎn)氣量; δ為產(chǎn)氣末期校正斜率; t為反應(yīng)時間; A為平衡產(chǎn)氣量; Rmax：最大產(chǎn)氣速率; λ：遲滯期. 底物的厭氧代謝過程實質(zhì)上是一系列的酶促反應(yīng)，因此采用Michaelis-Menten模型描述（description）剩余污泥濃度與比產(chǎn)氣速率的關(guān)系： V=Vmax ? S Km+S 式中，Vmax為最大比產(chǎn)氣速率[mL ?-1]; V為比產(chǎn)氣速率[mL ?-1]; Km為半飽和常數(shù); S為基質(zhì)濃度.
2 結(jié)果與討論
2.1 BMP產(chǎn)氣結(jié)果分析
AP-BM
P、 DH-BMP批次實驗持續(xù)時間分別為439
H、 765 h，6組不同的投配比設(shè)計累積產(chǎn)氣量存在著明顯的差異.實驗初期累積產(chǎn)氣量差異不明顯，后期逐步增大.兩組實驗氣體成分均以CH4、 CO2為主，同時存在少量的H2.實驗產(chǎn)氣均勻，可分為兩個階段.第一階段產(chǎn)氣速率大，產(chǎn)甲烷菌利用溶解性COD或易水解性物質(zhì)進行厭氧發(fā)酵; 之后產(chǎn)氣速率逐漸降低（reduce)至穩(wěn)定水平，該階段的限速步驟為剩余污泥的水解過程，產(chǎn)氣隨著水解的進程而穩(wěn)定增加.至該實驗結(jié)束時，每天仍有穩(wěn)定體積（volume)的氣體產(chǎn)生，表明微生物的水解、 厭氧產(chǎn)CH4仍在進行中.應(yīng)用改進的Gompertz模型對AP-BM
P、 DH-BMP產(chǎn)氣進行回歸后的參數(shù)如表2所示.兩廠的厭氧污泥產(chǎn)氣數(shù)據(jù)與改進的Gompertz模型擬合較好.通常厭氧消化過程中的限速步驟為水解破壁過程[21, 22]，在無添加外來基質(zhì)的0號樣品中，A
P、 DH厭氧污泥的遲滯期分別為20.00
H、 12.93 h，表明DH厭氧污泥的活性較高.
表2 改進Gompertz模型回歸BMP實驗（experiment)參數(shù)
圖2 Michaelis-Menten模型回歸BMP產(chǎn)CH4速率參數(shù)
采樣Michaelis-Menten模型對兩個批次實驗的基質(zhì)濃度、 比產(chǎn)氣速率回歸后的結(jié)果如圖2所示.A
P、 DH厭氧污泥的最大比產(chǎn)氣速率差距不大，分別為74.21、 51.99 mL ?-1，但兩廠厭氧污泥的Km存在著顯著的差異，DH厭氧污泥的Km為19 005 mg ?L-1而AP厭氧污泥的Km高達54 098 mg ?L-1.Km是表征底物親和力的常數(shù)，表明AP厭氧污泥對該廠剩余污泥的適應(yīng)性差，需要在較高的基質(zhì)濃度下才能表現(xiàn)出較好的產(chǎn)CH4性能.
2.2 水質(zhì)變化分析
AP-BM
P、 DH-BMP兩個批次實驗結(jié)束時不同F(xiàn)/M條件下的水質(zhì)狀況如下表3所示.兩個批次實驗中隨著F/M增大，pH由弱酸性漸變?yōu)槿鯄A性，分別位于在6.8~7.2、 6.7~7.1范圍內(nèi).0號呈弱酸性，可能由未添加基質(zhì)，厭氧污泥自身的水解造成[23].DH-BMP與AP-BMP實驗結(jié)束時ORP值分別位于-235~-280 mV與-235~-282 mV范圍內(nèi).隨著F/M比的增大，兩個批次實驗的ORP值都呈下降的趨勢.厭氧環(huán)境的主要標(biāo)志是發(fā)酵液具有低的ORP，不同的厭氧消化體系和不同的厭氧微生物對ORP的要求不同[24].
兩批次實驗中在高F/M條件下下CODT下降明顯.與AP-BMP實驗相比，DH-BMP實驗結(jié)束后CODT下降更為顯著，5號樣品中由之前的47 000 mg ?L-1下降至32 480 mg ?L-1，在高F/M條件下厭氧消化進行得更為完全.批次實驗前后，NH+4-N濃度均有提高，不同F(xiàn)/M條件下NH+4-N變化差異較大，DH-BMP實驗中5號樣品實驗結(jié)束后NH+4-N濃度達到了755.5 mg ?L-1.污泥厭氧消化過程中，污泥的水解是限速步驟（procedure).在高F/M條件下，厭氧污泥代謝旺盛，使得剩余污泥的破壁、 氨化過程進行得較為完全，從而使得NH+4-N顯著提升[4].兩個批次實驗前后TSS變化呈現(xiàn)出與CODT類似的趨勢，高F/M條件下下降趨勢明顯，DH-BMP實驗中5號樣品的TSS由實驗前的45 100 mg ?L-1下降至38 050 mg ?L-1.綜合比較AP-BMP與DH-BMP實驗前后水質(zhì)變化，DH-BMP實驗前后COD
T、 TSS下降趨勢更加明顯，表明DH-BMP過程中代謝活躍，厭氧消化過程進行得較為完全.
表3 BMP實驗?zāi)┢诓煌現(xiàn)/M條件下主要水質(zhì)
圖3 A
P、 DH剩余污泥厭氧消化前后主要T-RFs豐度變化
2.3 厭氧污泥生物多樣性分析
圖3表示了以AP-BM
P、 DH-BMP實驗前后產(chǎn)甲烷功能菌組成的變化情況.與AP-BM
P、 DH-BMP兩個批次實驗中產(chǎn)CH4、 水質(zhì)變化情況相一致，DH接種厭氧污泥中產(chǎn)甲烷菌群的相對含量高于AP接種厭氧污泥，AP-BMP中0號樣品的雜菌相對含量超過60%.DH厭氧污泥中產(chǎn)甲烷功能菌群豐富且相對含量較高，可能（maybe)是DH-BMP實驗中半飽和常數(shù)Km顯著低于AP-BMP中回歸數(shù)值的重要原因.
AP-BMP實驗（experiment)后，未添加基質(zhì)的0號實驗結(jié)束后雜菌相對含量降至14%，這可能（maybe)是由于基質(zhì)的缺乏，產(chǎn)甲烷菌將雜菌分解代謝造成.4號樣品中的雜菌含量也有所降低（reduce)但幅度不大.同時實驗結(jié)束后，兩組的產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)甲烷微菌Methanomicrobiaceae和RC-I的相對含量皆有提高.DH-BMP實驗前后產(chǎn)甲烷功能菌的組成變化情況與AP-BMP變化類似.DH-BMP實驗結(jié)束時雜菌含量降低，0號、 5號樣品中雜菌相對含量不足17%.產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)甲烷微菌Methanomicrobiaceae 和RC-I的相對含量皆有所提高，表明產(chǎn)甲烷菌的活性和相對豐度在實驗過程中得以提高.已有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.主要以乙酸為基質(zhì)生成甲烷[25]，實驗結(jié)束后產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.相對含量提高，而其它兩種產(chǎn)甲烷菌以H2和CO2為基質(zhì)生成甲烷，由于兩組BMP實驗中H2的生成量較低，因此產(chǎn)甲烷桿菌Methanobacteriacea 、 產(chǎn)甲烷微菌Methanomicrobiaceae相對含量變化不如產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.增加顯著[4].具體參見污水寶商城資料或
3 結(jié)論
A
P、 DH剩余污泥厭氧消化產(chǎn)CH4采用改進Gompertz模型回歸的最大比產(chǎn)氣速率數(shù)值接近，分別達到了74.21 mL ?-1、 51.99 mL ?-1，但對基質(zhì)剩余污泥的半飽和常數(shù)Km差異較大，分別為54 098 mg ?L-1和19 005 mg ?L-1，表明AP剩余污泥親和性差、 難于厭氧消化.
BMP實驗結(jié)束后，TS
S、 CODT有所下降，NH+4-N顯著提高，且高污泥負荷F/M條件下水質(zhì)變化趨勢更為顯著.與AP-BMP實驗相比，DH-BMP水質(zhì)變化顯著.
兩批次實驗前后T-RFLP分析(Analyse)結(jié)果與其生化產(chǎn)CH4勢相一致，實驗結(jié)束后雜菌（fungus)相對含量顯著下降，產(chǎn)甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.、 產(chǎn)甲烷微菌 Methanomicrobiaceae和RC-I的相對含量皆有所提高，且DH-BMP樣品中產(chǎn)甲烷功能菌群相對含量提升程度高于AP-BMP.
