消毒是污水處理過程中殺滅微生物的水處理過程，是保障污水處理廠尾水水質(zhì)安全必不可少的環(huán)節(jié).消毒處理在殺滅微生物的同時(shí)，也可能削減抗性基因.但是，目前對不同消毒削減抗性基因的影響因素和具體機(jī)制仍尚不明確.此外，消毒對抗性基因的削減效果還受到其抗性細(xì)菌影響，不同抗性細(xì)菌對其攜帶的抗性基因可能有不同的保護(hù)作用. Huang等對1株未攜帶抗性基因的大腸桿菌和攜帶tetA的大腸桿菌進(jìn)行紫外和氯消毒研究發(fā)現(xiàn)，攜帶抗性基因的菌株表現(xiàn)出更高的消毒耐受性.雖然目前對于氯消毒、紫外消毒、臭氧消毒等常規(guī)消毒方法殺滅細(xì)菌的機(jī)制有了較為成熟的理論，但抗性基因在消毒過程中的行為特征有待討論.本研究采用“消毒+DNaseI酶”實(shí)驗(yàn)來研究抗性基因在各消毒過程中的行為特征.有研究表明，DNA可游離于細(xì)胞體之外，成為游離態(tài)DNA，并在環(huán)境中維持較長時(shí)間.游離態(tài)DNA上的抗性基因則可能通過基因水平轉(zhuǎn)移途徑重新進(jìn)入細(xì)菌，繼續(xù)產(chǎn)生環(huán)境危害. DNaseI酶是1種DNA降解酶，應(yīng)用其對水環(huán)境中胞外游離態(tài)DNA進(jìn)行降解，有助于了解消毒方法削減水中抗性基因的機(jī)制.
磺胺類藥是人工合成（解釋:由幾個(gè)部分合并成一個(gè)整體)的抗生素，自1935年臨床應(yīng)用以來，僅80余年就已產(chǎn)生明顯的環(huán)境耐藥性問題.本研究從磺胺類抗性基因入手，分析氯消毒、紫外消毒、臭氧消毒等常規(guī)消毒方法對抗性基因的削減作用.從某污水處理廠二級出水中分離出磺胺類抗性細(xì)菌，并挑取典型的革蘭氏陽性菌和陰性菌各1株，確定其中的磺胺類抗性基因種類及菌株種類.以上述兩株細(xì)菌為實(shí)驗(yàn)（experiment)對象，污水廠二級出水滅菌后作為實(shí)驗(yàn)水樣，控制上述細(xì)菌濃度投加到實(shí)驗(yàn)水樣中，比較研究消毒對抗性細(xì)菌和抗性基因的削減效果.同時(shí)，利用“消毒+DNaseI酶”實(shí)驗(yàn)研究磺胺類抗性基因在消毒過程中的行為特征，以期為理解消毒削減抗性基因的機(jī)制，并為污水中抗性基因污染的控制方法提供新思路.
1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)菌株篩選
采集浙江臨安某污水處理廠氧化溝出水 ，采用稀釋、涂布分離方法在磺胺類選擇培養(yǎng)基平板上篩選磺胺類抗性細(xì)菌.磺胺類選擇培養(yǎng)基配置方法為：蛋白胨10 g ?L-1，酵母提取物5 g ?L-1，氯化鈉10 g ?L-1，調(diào)節(jié)pH至7后121℃、20 min高壓滅菌，在完全凝固前趁溫加入磺胺甲唑母液至濃度為50.4 μg ?mL-1.母液濃度40 mg ?mL-1，采用1 mol ?L-1 NaOH溶液在避光條件下溶解配置. 30℃、24 h培養(yǎng)后，挑取單菌落分離純化，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit 提取細(xì)菌DNA，由睿迪生物科技有限公司測定16S rRNA序列，測序結(jié)果通過使用NCBI網(wǎng)站 及16S rRN
A、intI1基因進(jìn)行定性檢測，分析其基因類型.
PCR體系為：10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol ?L-1，dNTP 2.0 μL，10 mmol ?L-1上游引物1.0 μL，10 mmol ?L-1下游引物1.0 μL，5U Taq酶0.3 μL，ddH2O 17.2 μL，DNA樣品1.0 μL.各基因引物見表 1.在PCR循環(huán)儀 中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min后，95℃變性15 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃下延伸7 min.普通PCR完成后，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，與6×Loading buffer Dye混合均勻后，使用經(jīng)EB染色的1.5%的瓊脂糖凝膠，在120 V電壓下電泳30 min檢測擴(kuò)增條帶.使用全自動(dòng)凝膠成像儀 對瓊脂糖凝膠進(jìn)行拍照，分析所得PCR產(chǎn)物長度并與表 1中提供的擴(kuò)增片段相比較.
表 1 各基因引物序列及退火溫度
本研究采用菌株為：
①瓊氏不動(dòng)桿菌，Acinetobacter junii，革蘭氏陰性，16S rRNA序列NCBI登錄號：KY120958;
②枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis，革蘭氏陽性，16S rRNA序列NCBI登錄號：KY121111.兩者均含有sul Ⅰ、sul Ⅱ ，不含有sul Ⅲ、sulA，故下文對磺胺類抗性基因的研究主要集中于sul Ⅰ、sul Ⅱ .
1.2 實(shí)驗(yàn)水樣準(zhǔn)備
將實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)30℃、24 h后的菌液10 000 r ?min-1離心10 min，棄上清液收集菌體，用無菌PBS重懸，利用0.5號麥?zhǔn)媳葷峁芸刂萍?xì)菌濃度約為1.5×108 CFU ?mL-1.污水處理廠二級出水采用0.22 μm膜進(jìn)行過濾滅菌后，將細(xì)菌PBS溶液以1 :14的比例投加至水樣中，使最終實(shí)驗(yàn)水樣細(xì)菌濃度約為107 CFU ?mL-1.
1.3 氯消毒
氯消毒劑采用次氯酸鈉溶液，將其稀釋至有效氯10 g ?L-1，并置于棕色試劑瓶中在4℃下避光保存，實(shí)驗(yàn)前測定實(shí)際有效氯含量后立即使用.取1 L水樣，滴加次氯酸鈉溶液，使樣品中的有效氯濃度依次達(dá)到設(shè)定值 .實(shí)驗(yàn)水樣體積為1 L，氯消毒接觸時(shí)間為30 min.在氯消毒完成后，投加5 mg ?L-1的硫代硫酸鈉溶液終止消毒反應(yīng).每次消毒實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同.
1.4 紫外消毒
紫外線消毒處理在實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)的紫外線平行光束儀裝置內(nèi)進(jìn)行，平行光束儀內(nèi)含有5根不同功率的低壓紫外UV254燈管，燈光水平中心線距離實(shí)驗(yàn)水樣表面50 cm.紫外線平行光束儀裝置示意如圖 1所示，從燈管發(fā)出的紫外線經(jīng)平行光柱，均勻地輻照到反應(yīng)容器 .實(shí)驗(yàn)水樣體積為1 L，控制紫外燈強(qiáng)度不變，通過調(diào)節(jié)照射時(shí)間以獲得不同的紫外劑量 .為避免光復(fù)活效應(yīng)，經(jīng)紫外消毒處理后，立即進(jìn)行下一步的樣品處理和檢測.
圖 1 紫外消毒與臭氧消毒裝置示意
1.5 臭氧消毒
臭氧消毒處理采用VMUS-DG臭氧發(fā)生器 .氣路上裝有流量計(jì)和臭氧分析儀UV100，用以測量進(jìn)出氣體中的臭氧濃度，如圖 1所示.實(shí)驗(yàn)水樣體積為1 L，通過調(diào)節(jié)氣體流速和臭氧濃度，使臭氧消毒接觸時(shí)間為10 min時(shí)，臭氧投加量達(dá)到目標(biāo)設(shè)定值 .
1.6 DNaseI處理
向消毒處理后的水樣中加入500 U單位DNaseI ，15℃反應(yīng)振蕩2 h.
1.7 菌落計(jì)數(shù)法
本研究使用菌落計(jì)數(shù)法來確定水樣中的磺胺類抗性細(xì)菌數(shù)目.用無菌水對水樣進(jìn)行梯度稀釋，各取100 μL水樣稀釋液于磺胺類選擇培養(yǎng)基平板上，用玻璃刮刀涂布均勻，平行3份，30℃、24 h培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù) .
1.8 熒光定量PCR
本研究使用熒光定量PCR法檢測抗性基因的絕對豐度.水樣采用FastDNA Spin Kit forsoil試劑盒 提取DNA，使用微量蛋白質(zhì)(protein)核酸分析儀 測定DNA濃度，置于-85℃保存.
熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：普通PCR擴(kuò)增得到的目的基因序列使用Biospin凝膠回收試劑盒 進(jìn)行純化回收PCR產(chǎn)物，后測量DNA含量、純度并調(diào)節(jié)至合適濃度后，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入E. coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將感受態(tài)細(xì)胞涂于含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12~16 h;通過藍(lán)白斑篩選挑取白色重組菌斑，挑選陽性克隆子用LB培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液混濁后，取1 mL菌液測序插入基因片斷.測序結(jié)果通過使用BLAST進(jìn)行序列同源性檢索比對;其余3~4 mL菌液用來提取質(zhì)粒，使用QIAGEN質(zhì)粒專用提取試劑盒 進(jìn)行質(zhì)粒抽提，確保質(zhì)粒DNA的A260/A280比值在1.8左右.符合要求的質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算其濃度[質(zhì)粒濃度的計(jì)算公式為：濃度=×6.02×1023].將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍稀釋，并且保持質(zhì)粒濃度在108~102之間.標(biāo)線擴(kuò)增效率見表 1.
定量PCR反應(yīng)在Bio-rad IQ5熒光定量PCR儀器 中進(jìn)行.定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)液體系：7.5 μL SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3 μL ROX Reference溶液，0.3 μL濃度為10 mmol ?L-1濃度的正向引物，0.3 μL濃度為10 mmol ?L-1濃度的反向引物，4.6 μL ddH2O.反應(yīng)液體系在100 μL 96孔反應(yīng)板的反應(yīng)孔中進(jìn)行.定量PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃下熱變性30 s;然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段，包括95℃變性5 s，退火30 s，72℃延伸30 s，延伸的同時(shí)掃描熒光信號.溶解曲線程序?yàn)?5~95℃之間，每0.5℃讀數(shù)，其間停留30 s.每個(gè)樣品做3次重復(fù).
1.9 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)采用Excel 2010和Origin 9.0軟件進(jìn)行分析.
2 結(jié)果與討論2.1 3種消毒方法對磺胺類抗性細(xì)菌的削減效果
不同消毒方法對實(shí)驗(yàn)水樣中的磺胺類抗性菌株均有一定的去除效果，且在低劑量濃度下，抗性細(xì)菌的削減效果隨著消毒劑量的增加而提高，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最高劑量 下，實(shí)驗(yàn)水樣中的抗性細(xì)菌大多已被滅活，如圖 2所示.當(dāng)消毒劑量達(dá)到一定水平后，抗性細(xì)菌均不能被菌落計(jì)數(shù)法檢測.在兩種細(xì)菌的比較中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 的耐受性強(qiáng)于瓊氏不動(dòng)桿菌 ，這可能與革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁保護(hù)作用有關(guān)，其能阻礙自由氯和臭氧分子的穿透，一定程度上保護(hù)細(xì)菌.在紫外消毒中，McKinney等[10]也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，他們深入研究后認(rèn)為，這可能與兩種細(xì)菌基因序列中總基因組大小不同有關(guān).紫外消毒導(dǎo)致DNA中的嘧啶經(jīng)過光化學(xué)的破壞，相鄰胸腺嘧啶產(chǎn)生二聚作用.細(xì)菌的DNA中多數(shù)胸腺嘧啶二聚物的形成阻止了DNA復(fù)制和最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，達(dá)到消毒的目的.革蘭氏陽性菌的總基因組更小，意味著它們有更少的潛在嘧啶二聚體目標(biāo)，所以枯草芽孢桿菌對紫外的敏感性更低.
G-ARB：瓊氏不動(dòng)桿菌（fungus)水樣;G+ARB：枯草芽孢桿菌水樣;ARB存活率為存活量與初始量的比值，兩者單位為CFU ?mL-1
圖 2 不同消毒方法中磺胺類抗性細(xì)菌數(shù)量的變化
對消毒劑消毒效果的比較，可以采用CT值 來衡量. CT值是消毒劑的濃度和作用時(shí)間的乘積，用于比較消毒劑殺菌作用的指標(biāo)，CT值越低消毒效果越好.將氯消毒和臭氧消毒相對比，當(dāng)瓊氏不動(dòng)桿菌的削減率達(dá)到3個(gè)數(shù)量級左右時(shí)，氯消毒的CT值為90 mg ?-1，而臭氧消毒的CT值為20 mg ?-1，可以看出，臭氧的CT值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于氯.因此臭氧削減目標(biāo)細(xì)菌所需時(shí)間更短，效率更高.此外，污水廠常使用紫外消毒作為深度處理工藝，使用的輻照劑量在30 mJ ?cm-2以下.本研究（research)中，25 mJ ?cm-2消毒劑量下，瓊氏不動(dòng)桿菌和枯草芽孢桿菌基本滅活，研究表明通常污水廠所設(shè)置的輻射劑量能滅活磺胺類抗性細(xì)菌.
2.2 3種消毒方法對磺胺類抗性基因的削減效果
目前各消毒方法的評價(jià)都是以微生物的削減程度來衡量的，但是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)削減微生物的量并不直接等同于削減抗性基因的量. 圖 3為實(shí)驗(yàn)水樣在不同消毒劑量下磺胺類抗性基因的變化情況，可知在消毒過程中，磺胺類抗性基因大體上是隨著消毒劑量的增加而下降的.氯消毒中削減效果較為明顯，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最低濃度1 mg ?L-1時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌水樣的sul Ⅱ 絕對豐度削減率為78.9%，枯草芽孢桿菌水樣的sul Ⅱ 絕對豐度削減率為70.5%. sul Ⅱ 的削減率要高于sul Ⅰ ，但是隨著消毒劑量的上升，sul Ⅰ 基因豐度也有明顯的下降，氯消毒濃度達(dá)到3 mg ?L-1，枯草芽孢桿菌水樣的sul Ⅰ 絕對豐度削減率由2 mg ?L-1的29.7%上升到77.9%.在氯消毒濃度達(dá)到4 mg ?L-1時(shí)，兩種不同目標(biāo)細(xì)菌sul Ⅰ 、sul Ⅱ 絕對豐度削減率都能達(dá)到95.0%以上.瓊氏不動(dòng)桿菌水樣與枯草芽孢桿菌水樣磺胺類抗性基因的基因豐度隨氯消毒濃度的變化規(guī)律基本一致，但瓊氏不動(dòng)桿菌水樣的削減率高于枯草芽孢桿菌水樣.結(jié)合磺胺類抗性基因豐度和16S rRNA基因豐度之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，氯消毒過程中，瓊氏不動(dòng)桿菌水樣中sul Ⅱ 基因與16S rRNA基因呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系 ，R2為0.90;枯草芽孢桿菌水樣中sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因均與16S rRNA基因呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系 ，R2分別為0.77和0.5
9. 16S rRNA基因的豐度在一定程度上反映了樣品中的微生物量，這表明氯消毒削減磺胺類抗性基因主要和微生物量的降低有關(guān).
G-sulⅠ、G-sulⅡ：瓊氏不動(dòng)桿菌水樣中sulⅠ、sulⅡ基因;
G+sulⅠ、G+sulⅡ：枯草芽孢桿菌水樣中sulⅠ、sulⅡ基因
圖 3 不同消毒方法中磺胺類抗性基因絕對豐度的變化
圖 4 氯消毒中瓊氏不動(dòng)桿菌16S rRNA與sulⅡ擬合曲線
紫外消毒和臭氧消毒對磺胺類抗性基因的削減效果一般，在設(shè)置的最高劑量 下，sul Ⅰ 絕對豐度削減率為84.9%、84.6% 和77.4%、84.3%，sul Ⅱ 絕對豐度削減率為89.9%、86.2% 和85.7%、87.2%，抗性基因絕對豐度僅下降(descend)不到一個(gè)數(shù)量級，仍處于較高程度.同時(shí)，有研究認(rèn)為，低劑量氯消毒 促進(jìn)細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移，在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，消毒對抗性基因的抑制作用可能更弱.臭氧消毒過程中磺胺類抗性基因的削減規(guī)律呈現(xiàn)波動(dòng)，臭氧消毒濃度為0~6 mg ?L-1時(shí)，削減情況呈現(xiàn)波動(dòng)，對磺胺類抗性基因基本無削減效果 ，濃度達(dá)到8 mg ?L-1時(shí)平均削減率升至55.3%，呈現(xiàn)一定下降趨勢，可以認(rèn)為低濃度臭氧消毒對磺胺類抗性基因的削減效果并不明顯.比較臭氧消毒和氯消毒對磺胺類抗性基因的削減效果，當(dāng)枯草芽孢桿菌sul Ⅰ 絕對豐度削減率達(dá)到80.0%左右時(shí)，氯消毒的CT值為90 mg ?-1，而臭氧消毒的CT值為100 mg ?-1，其他情況下也能分析(Analyse)到相似結(jié)論，這與削減抗性細(xì)菌的結(jié)果截然相反.氯消毒過程中，抗性基因的削減與微生物量減少相關(guān)，這表明臭氧消毒中，抗性基因的減少可能不是由于微生物量的減少，抗性細(xì)菌減少時(shí)抗性基因仍得到一定程度的保存.同時(shí)，磺胺類抗性基因豐度和16S rRNA基因豐度的相關(guān)性分析表明，兩種水樣sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因均與16S rRNA基因相關(guān)性不顯著 .臭氧消毒和紫外消毒中，抗性細(xì)菌被殺滅后，抗性基因的行為特征需要進(jìn)行深入研究.
此外，對兩種細(xì)菌進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，兩者在氯消毒和紫外消毒過程中的變化規(guī)律基本一致，但是瓊氏不動(dòng)桿菌 中磺胺類抗性基因的削減率高于枯草芽孢桿菌 .在3 mg ?L-1氯消毒濃度時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因削減率分別為94.8%和97.4%，而枯草芽孢桿菌sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因削減率為77.8%和83.3%，表明磺胺類抗性基因在不同種類細(xì)菌中對氯消毒的耐受性有一定差別，革蘭氏陽性菌耐受性強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，這與抗性細(xì)菌的削減情況相同，符合氯消毒削減磺胺類抗性基因主要和微生物(Micro-Organism)量的降低有關(guān)的結(jié)論.在10 mJ ?cm-2紫外消毒劑量時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因削減率分別為71.4%和60.0%，而枯草芽孢桿菌sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因削減率為37.2%和38.6%，表明紫外消毒中抗性基因的削減仍受到細(xì)菌種類的影響.值得注意的是，有研究對污水紫外消毒進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，UV消毒在減小細(xì)菌多樣性的同時(shí)，會(huì)提高抗性基因在污水中的相對豐度.抗生素抗性細(xì)菌和非抗性細(xì)菌在紫外消毒過程中的不同表現(xiàn)同樣會(huì)減少抗性基因的削減率.在臭氧(Oxygen)消毒中，兩種細(xì)菌的削減率變化無明顯規(guī)律，臭氧消毒可能與細(xì)菌種類無明顯關(guān)系.
2.3 應(yīng)用DNaseI研究消毒中磺胺類抗性基因削減的機(jī)制
3種消毒方法均能削減兩種目標(biāo)細(xì)菌豐度和抗性基因豐度，但細(xì)菌和基因豐度的削減程度相差很多，例如20 mJ ?cm-2紫外消毒下，消毒前后細(xì)菌濃度相差5個(gè)數(shù)量級，而抗性基因的豐度相差僅為0~1個(gè)數(shù)量級，磺胺類抗性基因豐度仍高達(dá)105~106 copies ?mL-1.表明基因在其細(xì)菌被殺死后可能仍獨(dú)立于細(xì)胞體外存留，抗生素抗性基因亦可能包含其中，并在特定條件下，又會(huì)進(jìn)入其他細(xì)胞中重新表現(xiàn)出耐藥性，從而繼續(xù)傳播.本研究選擇3 mg ?L-1、10 mJ ?cm-2、6 mg ?L-1 劑量消毒后實(shí)驗(yàn)水樣，進(jìn)行DNaseI處理，圖 5為DNaseI處理前后實(shí)驗(yàn)水樣中磺胺類抗性基因豐度的變化情況(Condition).經(jīng)過DNaseI處理后，目標(biāo)細(xì)菌磺胺類抗性基因豐度均有明顯的下降.其中，臭氧消毒前后磺胺類抗性基因豐度變化最大，例如瓊氏不動(dòng)桿菌氯消毒、紫外消毒水樣中sul Ⅰ 基因在DNaseI處理前后比例分別為28.5%和67.5%，而臭氧消毒水樣在DNaseI處理后僅剩4.3%，即有95.7%的去除率，明顯高于氯消毒和紫外消毒.氯消毒水樣中經(jīng)過DNaseI處理后的去除率基本高于紫外消毒.實(shí)驗(yàn)表明，臭氧消毒后，磺胺類抗性基因主要存在于水環(huán)境中的游離態(tài)DNA.
圖 5 DNaseⅠ處理前后磺胺類抗性基因豐度的變化
對DNaseI處理前后16S rRNA和intⅠ1基因變化分析發(fā)現(xiàn) ，DNaseI對16S rRNA基因豐度有一定的削減效果 ，總體削減率在50.0%左右.其中在紫外消毒和氯消毒后DNaseI對16S rRNA基因豐度的削減率在42.0%~74.0%，削減率相對于臭氧消毒高.在不同消毒方法處理后DNaseI對intⅠ1基因豐度的削減情況(Condition)不相同，臭氧消毒后DNaseI對intⅠ1基因豐度削減率最高，氯消毒和紫外消毒后DNaseI對intⅠ1基因豐度削減率低. intⅠ1基因作為1種水平基因轉(zhuǎn)移元件，可以認(rèn)為是抗性基因在游離態(tài)DNA中的主要載體之一.結(jié)合
