目前，隨著現代工業的不斷發展，大量有毒有害廢水排入到環境中，苯酚(phenol)作為樹脂制造、煉油、制藥、焦碳原料等工業過程中的重要工業原料和產生的一種有機污染物，是工業污水中的主要有害物質，會對動、植物產生有毒甚至致命的危害.苯酚對水生生物具有很強的毒害作用，水體中5~25 mg · L-1的濃度即可對魚類的生存構成威脅.長期飲用被苯酚污染的水或吸入低濃度酚蒸汽或會引起長期累積性中毒，而飲用高濃度酚溶液、吸入高濃度酚蒸汽則將引起急性中毒，尤其對人體神經系統危害較大.美國環保署把苯酚列入129種優先污染物和65種有毒污染物之列，我國也把苯酚列入中國環境優先處理的污染物“黑名單”之中.因此，去除水體中的苯酚等酚類污染物已成為污水處理的重要課題.
降解酚類的方法主要包括吸附法，電化學法和生物降解法等，其中生物降解因投資與運行成本低、二次污染小、處理效率高等優點，因而廣泛應用于含酚廢水處理.近年來，許多學者在這方面進行了大量的研究，從被酚類物質污染的環境中已分離得到多種降解酚類的微生物菌株，主要有根瘤菌、酵母菌、醋酸鈣不動桿菌、假單胞菌、真養產堿菌、反硝化菌、紅球菌等.其中，大部分研究主要集中于酵母菌、芽孢桿菌以及假單胞桿菌，對Acinetobacter屬的細菌較少報道.生物降解法處理有毒和難降解的工業廢水時，一般需要利用生物強化技術來馴化、篩選、誘變和選育高效微生物降解利用有毒有害物質，但工業廢水組成成分的動態變化特點易對生物系統造成沖擊，使其中的高效降解微生物菌群致死、流失.利用高效降解微生物對苯酚進行生物降解，能有效去除水體中的苯酚，但降解過程的影響因素較多，有必要從諸多影響因素中篩選出最為重要的影響因素，控制生物降解系統能較好的耐受環境沖擊并高效運轉.由于傳統單因素實驗不能確定主次因素的差別，而Plackett-Burman實驗廣泛應用于生物過程重要參數的篩選，通過對實驗進行統計學設計和數據分析，篩選出對目標值影響最大的關鍵因素.響應面分析法是一種優化過程的有效方法，其中的Box-Behnken實驗設計法比較常用，可用于確定實驗因素及其交互作用在過程中對指標響應值的影響，精確的表述因素與響應值之間的關系.該法與正交設計比較，所需實驗組數相對較少，更能直觀體現因變量的最佳值.
本研究從株洲某化工廠污水處理車間氧化池的活性污泥中篩選分離出一株能高效降解苯酚的細菌（fungus)菌株YH8，根據其形體特征、生理生化性狀、BIOLOG鑒定、16S rDNA和gyrB序列分析進行分類鑒定，研究了該菌株降解苯酚的特性和初步探討了該菌株降解苯酚的途徑，并利用響應面法優化（optimalize）菌株YH8降解苯酚的條件以提高降解效率.
2 材料與方法
2.1 實驗材料
2.1.1 樣品來源
從株洲市某化工廠廢水處理車間氧化池采集的活性污泥作為篩選降解菌株的樣品.
2.1.2 培養基
種子培養基:每升含酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，pH 7.0~7.2.無機鹽培養基:每升含K2HPO4 0.4
G、KH2PO4 0.4
G、NaCl 0.1
G、2SO4 0.04
G、MgSO4 · 7H2O 0.1
G、MnSO4 · H2O 0.01
G、Fe23 · H2O 0.01
G、NaMoO4 · 2H2O 0.01 g，加水定容至1000 mL. 選擇培養基:在已滅菌的MS培養基中，按濃度要求加入經0.22 μm微孔濾膜過濾的苯酚母液，pH 7.0.以上固體培養基需加入1.8%的瓊脂粉，經121 ℃、20min高壓滅菌備用.
2.2 實驗方法
2.2.1 菌株的分離純化
準確稱量氧化池活性污泥10 g，加入到裝有90 mL三級水的錐形瓶中，30 ℃、200 r · min-1恒溫搖床中振蕩培養1 h.將重懸液按2%接種量加入到含苯酚的選擇培養基中，苯酚濃度按100、200、500、1000、1200、1500、2000 mg · L-1依次提高以梯度馴化與富集降解菌.經過多次轉接培養，梯度稀釋培養液并涂布于含苯酚固體選擇培養基上，在30 ℃恒溫培養箱中倒置培養12 h.挑取菌落形態不同的單菌落接種至LB平板上，反復劃線分離純化得到純菌株，保存于4 ℃冰箱中備用.
2.2.2 降解菌的篩選
將保藏的純化菌株接種至LB平板上，劃線分離單菌落.挑取單菌落接種到LB液體培養基中，30 ℃、200 r · min-1振蕩培養至OD600為2.0.連續活化3代后，用生理鹽水將發酵液離心洗滌2次并重懸菌體.以2%接種量接種至選擇培養基中，振蕩培養并間隔12 h檢測培養液中苯酚含量，從中挑選降解苯酚能力最強的菌株.
2.2.3 形態特征鑒定
肉眼觀察降解菌的菌落形狀、大小、顏色、透明度、粘稠度、濕潤度、隆起和邊緣特征及是否產色素等，菌體染色后用高倍顯微鏡觀察菌體革蘭氏染色、鞭毛、莢膜、芽孢等結構，利用日立S-3400N型掃描電鏡觀察菌體大小和表面結構.
2.2.4 生理生化特性測定
參照文獻進行生理生化鑒定，另采用BIOLOG全自動鑒定儀比對代謝指紋進行鑒定.采用添加5 μg · mL-1的抗生素，濃度梯度為50、100、400、500、800、1000、1200、1500、2000 mg · L-1的重金屬鹽的LB培養基培養YH8，檢測菌株的相關抗性.
2.2.5 16S
rDNA基因序列的測定及分子系統發育樹的構建 細菌基因組DNA采用EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒，依據說明書提取.16S rDNA基因序列的獲取參照文獻.PCR產物經瓊脂糖電泳檢測純化，送生工進行雙向測序并拼接輸出全序列，16S rDNA序列用BLAST進行相似性搜索和同源性比對，采用ClustalX 1.8進行序列匹配分析，通過MEGA6.0軟件使用鄰接法構建系統發育樹，利用Bootstrap檢驗各分支的置信度.
2.2.6 gyrB基因序列的測定及分子系統發育樹的構建
gyrB基因是普遍存在于細菌中編碼促旋酶B亞單位的基因，該基因進化速率快，每100萬年的平均堿基替換率為0.7%~0.8%，gyrB基因彌補了非蛋白編碼基因16S rDNA無法區分近源種的缺陷.以提取的細菌基因組DNA為模板，采用gyrB的保守引物對UP-1F/UP-2R進行PCR擴增，PCR反應體系及反應步驟參照文獻.利用測序引物UP-1S:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2sr: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′雙向測序并連接，gyrB序列構建系統發育樹的方法同上.
2.3 優化降解條件
經單因素實驗確定影響YH8降解苯酚的環境因素.以苯酚降解率為響應值，采用三步法進行苯酚降解的優化.首先，利用Plackett-Burman設計選出對菌株降解苯酚效率影響較大的因素，然后利用最陡爬坡設計逼近最佳區域，最后利用響應曲面法中的Box-Benhnken設計進行實驗.通過實驗數據擬合響應面模型，最終確定最優降解條件并進行驗證.實驗數據借助SPSS和Design Expert軟件進行分析.
2.4 苯酚降解機理的研究
2.4.1 細胞粗酶液的提取
將篩選到的菌株YH8接種至選擇培養基和LB培養基中，30 ℃、200 r · min-1振蕩培養32h，取對數生長期末期菌液50 mL，4 ℃、12000 r · min-1離心10 min，上清液即為胞外粗酶液，于-20 ℃凍存.菌體沉淀用pH 7.0的磷酸緩沖液清洗兩次后，重懸于磷酸緩沖液中.在冰浴中，用HUP-400A型超聲波細胞破碎儀破碎細胞，超聲破碎30 s，間隔30 s，連續處理10 min.于4 ℃、13000 r · min-1離心20 min，上清液即為胞內粗酶液，于-20 ℃凍存.
2.4.2 菌株降解苯酚相關基因的PCR擴增
以細菌（fungus)基因組DNA為模板，擴增苯酚羥化酶、鄰苯二酚2，3-雙加氧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶基因片段.LmPH引物為Lph:5′-AGGCATCAAGATCACCGACTG-3′;Lph
2:5′-CGCCAGAACCATTTATCGATC-3′. C23O引物為C23OF:5′-GGTCTGATYGAAATGGAYCGCGA-3′;C23OR:5′-CGTTCGTTSAGCACCCGGTCGTG-3′. C12O引物為C12OF:5′-CCTGARCBGTHGGYTTT GCNCGTATGGATGA-3′;C12OR: 5′-TCACGRGTW GCRWARGCAAAGTC-3′.上述基因片段擴增體系與16S rDNA基因序列擴增體系相同，LmPH引物的PCR反應程序為:94 ℃預變性5min;94 ℃變性30s，52 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30個循環;72 ℃延伸10min.C12O和C23O的引物的PCR反應程序為:94 ℃預變性3min;94 ℃變性30s，59 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30個循環;72 ℃延伸10min.PCR產物經瓊脂糖電泳檢測、純化、測序，測序結果用BLAST軟件與Genbank數據庫中已收錄的基因序列進行同源性比對.
2.4.3 質粒的檢測與消除
采用堿裂解法抽提質粒.質粒消除采用變溫-SDS法.采用點接法將單菌落按相同位置接種至LB和選擇培養基的平板上，對能在LB平板上生長而不能在選擇培養基上生長的菌株進行質粒檢測.挑取質粒消除突變菌株利用LmPH和C12O引物進行PCR擴增，檢測突變菌株是否存在LmPH和C12O基因.
2.5 分析方法
2.5.1 細胞濃度的測定
采用可見分光光度法在600 nm下測定培養液的吸光度.
2.5.2 苯酚濃度的測定
采用4-氨基安替比林直接分光光度法測定苯酚的包含比重.
2.5.3 粗酶液活性測定
苯酚羥化酶活性的測定參照文獻.分別參考文獻檢測(檢查并測試)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶和鄰苯二酚2，3-雙加氧酶催化降解鄰苯二酚的產物粘糠酸和2-羥基粘糠酸半醛，分別在260 nm和375 nm處有最大吸收峰.C12O和C23O酶活力測定以單位時間內反應產物分別在260 nm和375 nm處吸光度變化表示.反應體系為8.01 mL鄰苯二酚、0.39 mL磷酸緩沖液和0.6 mL粗酶液，以緩沖液為參比.定義C12O活力單位為25 ℃條件下每分鐘反應產生1 μmol產物所需酶量.總蛋白包含比重用Bradford法測定，具體方法參見全式金Easy Protein Quantitative Kit試劑盒說明書.酶的比活力以每毫克的蛋白質中所含酶的活力單位數計算.
3 結果與討論
3.1 菌株的分離與純化
從活性污泥中分離純化得到單菌落，劃線分離后獲得58株苯酚降解菌.通過復篩得到一株苯酚降解能力最強的菌株，命名為YH8.在馴化前，菌株YH8在苯酚濃度為1000 mg · L-1的選擇培養基中，經30 ℃、200 r · min-1培養2d可使苯酚降解率達到78.54%.采用梯度濃度馴化后，菌株YH8可在4d內使1200 mg · L-1的苯酚降解89.47%.
3.2 菌株的鑒定
3.2.1 形態（pattern)特征鑒定
菌株YH8的菌落呈圓形、淺白色、中間隆起、邊緣整齊、濕潤有光澤、較透明、較粘稠、不產色素.菌株細胞呈短桿狀，有莢膜，無鞭毛與芽孢.經掃描電鏡觀察該菌在LB和選擇培養基生長的菌株細胞差異，正常細胞表面較光滑，而苯酚則使該菌細胞表面出現凹陷.因苯酚在水溶液水解成酸性，高濃度的苯酚對細胞有一定的毒害作用，故選擇培養基中培養的細胞易出現破損等現象.
圖1 YH8在LB中的掃描電鏡圖
圖2 YH8在苯酚中的掃描電鏡圖
3.2.2 生理生化鑒定
菌株YH8生理生化指標如下:革蘭氏染色陰性、氧(Oxygen)化酶陰性、過氧化氫酶陽性、苯丙氨酸脫氨酶陰性、吲哚實驗陰性、淀粉水解陰性、硫化氫陰性、三糖鐵陰性、硝酸鹽還原陽性、V-P實驗陰性、甲基紅陰性、明膠液化陽性、纖維素酶陰性，4 ℃可生長，40 ℃不能生長，不具有運動性.將菌株YH8細胞懸浮液接種至BIOLOG GN2板微孔中，培養4h和16h后分別測定菌株代謝指數.經BIOLOG特殊結構：莢膜、鞭毛、菌毛鑒定系統分析，菌株YH8代謝指數與Acinetobacter guillouiae的相似性為94%.
重金屬抗性實驗發現，菌株YH8能在分別添加1.0 g · L-1 Pb2+、1.5 g · L-1 Cr6+、1.8 g · L-1 Cr3+、0.5 g · L-1 Cd2+、1.0 g · L-1 Sb3+、3.0 g · L-1 Mn2+、1.0 g · L-1 Cu2+和1.0 g · L-1 Zn2+的LB培養基中正常生長，低于1 g · L-1的Cr3+、Mn2+、Zn2+可促進菌株的生長，而Cd2+、Hg2+、Ag+對菌株的生長有強烈的抑制作用.同樣，龔斌從含有一定濃度的Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+的酚類廢水中篩選到一株具有重金屬抗性的假單胞菌JF-10，可用于重金屬污染水體的苯酚污染生物修復.藥敏實驗結果表明菌株YH8能耐受5 μ g · mL-1的氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素，而對四環素、慶大霉素、壯觀霉素、頭孢噻肟鈉和利發霉素敏感.菌株在NaCl濃度為1%~12%的選擇培養基中生長，表明菌株YH8可適應較高滲透壓的環境.
3.2.3 分子生物學鑒定
菌株YH8的16S rDNA經PCR擴增得到一條約1.5Kb的DNA片段，測序得到1448bp的序列，其GenBank登錄
號為KM658327.16S rDNA序列BLAST結果表明，菌株YH8與Acinetobacter guillouiae和Acinetobacter lwoffi的16S rDNA序列具有極高的同源性.構建的16S rDNA序列系統發育樹表明菌株YH8與多株不動桿菌處在同一個分支.
圖3 菌株YH8的16S rDNA基因系統發育樹
經PCR擴增獲得一段約1.3 kb的DNA片段，測序得到1182bp的序列，其GenBank登錄號為KM658329.gyrB序列BLAST結果表明，菌株YH8與Acinetobacter baylyi的gyrB序列具有很高的同源性，而與其它菌株gyrB基因相似性均在98%以下，系統發育分析表明，菌株YH8與Acinetobacter baylyi同處在一分支.因NCBI數據庫中暫未收錄Acinetobacter guillouiae的gyrB序列數據，故gyrB基因系統進化樹中與YH8同一分支中未出現Acinetobacter guillouiae.綜合16S rDNA和gyrB基因序列分析以及菌株形態和生理生化特征，菌株YH8鑒定為Acinetobacter guillouiae.
圖4 菌株YH8的gyrB基因系統發育樹
3.3 苯酚代謝途徑及相關降解酶特性測定
3.3.1 降解酶基因擴增
按試劑盒說明從菌株YH8中提取到基因組DNA.分別利用LmP
H、C12
O、C23O引物對菌株YH8的基因組DNA進行PCR擴增，結果發現引物LmP
H、C12O有明顯的擴增產物，而C23O引物無明顯的擴增產物.將擴增產物測序，獲得LmPH基因大小為691 bp的片段，C12O基因大小為359 bp的片段.測序比對結果表明，菌株YH8的LmPH基因序列與登錄號為D85083.1的LmPH序列同源性最高，達到97%;該菌株的C12O序列與登錄號為Z36909.1的C12O序列同源性最高，達到96%.故證明菌株YH8基因組中包括LmPH和C12O基因.苯酚代謝途徑的限速步驟由第一步的苯酚羥化酶的催化決定，自然環境中有單組分和多組分兩種苯酚羥化酶，而多組分苯酚羥化酶是自然環境的優勢類型.通過染色體步移技術克隆得到 總長約為6 kb的苯酚羥化酶基因，其中ORF4編碼苯酚羥化酶大亞基，與編碼產堿桿菌苯酚羥化酶大亞基基因的同源性達到93%，為構建高效基因工程菌提供了一定的理論基礎.
圖5 苯酚羥化酶基因片段和鄰苯二酚1，2雙加氧酶基因片段的擴增產物
3.3.2 降解酶活性測定
通過測定菌株YH8粗酶液中LmP
H、C12O和C23O的活性，初步判斷該菌株YH8降解苯酚的代謝途徑.菌株YH8粗酶活性檢測表明，菌株YH8在LmPH的催化作用將苯酚轉化為鄰苯二酚，鄰苯二酚在C12O的作用下通過鄰位開環裂解途徑降解.這與運用氣質聯用儀分析(Analyse)生物滴濾塔處理后的苯酚氣體檢測到的結果一致，推測苯酚的轉化形式也相同.菌體破碎后上清液中LmPH和C12O的活性遠高于未破碎菌體上清液中酶活性，由此可見該酶為胞內酶.以LB培養基為基質的兩種上清液均未檢測到酶活，而選擇培養基中酶活遠大于LB培養基中酶活，說明該菌株LmPH和C12O為誘導酶.在研究四溴雙酚A的微生物降解特性時，降解TBBPA的菌株H粗酶液中同樣檢測到一條明顯區別于純培養菌株的蛋白條帶，證明紅球菌株H相關降解酶是受TBBP誘導的特異性降解酶.
表1 不同基質中苯（化學式：C6H6） 酚相關降解酶比活力
3.3.3 質粒檢測和消除結果
采用全式金transgen Plasmid MiniPrep Kit試劑盒抽提菌株細胞中的質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測出現3條目的條帶，說明菌株YH8具有一個5 kb左右的質粒.經變溫-SDS法消除質粒后，通過點解法得到只能在LB平板上生長而不能在僅含濃度為1000 mg · L-1 苯酚的MS培養基平板上生長的菌株，質粒消除率可達57.73%.經質粒檢測，在質粒消除后的突變菌株中未發現質粒.挑取質粒消除突變菌株培養并經PCR擴增檢測，無LmPH和C12O基因擴增條帶出現.這說明經質粒消除后的菌株不能利用苯酚作為唯一碳源生長，且可初步判定苯酚相關降解基因位于質粒上.結果與對不動桿菌質粒及其特性的研究結果一致.
