目前,對(duì)腈綸廢水的研究主要集中在強(qiáng)化預(yù)處理和深度處理等方面[5,6,7].研究表明,采用高級(jí)氧(Oxygen)化技術(shù)對(duì)腈綸聚合廢水進(jìn)行分質(zhì)強(qiáng)化預(yù)處理可以獲得較好的處理效果[8,9],以Fenton氧化預(yù)處理干法腈綸聚合廢水為例,處理后廢水COD可由1200 mg ?L-1降至600 mg ?L-1左右,污染負(fù)荷和生物毒性大幅降低,廢水可生化性明顯提高[10].物化預(yù)處理雖然可以改善廢水的水質(zhì)和可生物降解性,但處理后的出水仍需進(jìn)一步的生化處理,以實(shí)現(xiàn)廢水的達(dá)標(biāo)排放或回用.此外,腈綸廢水中高濃度有機(jī)氮和氨氮的去除也需要由生化處理過程來完成,這就要求生化處理工藝必須具有比較高的脫氮效能.序批式膜生物反應(yīng)器是序批式生物反應(yīng)器與膜分離技術(shù)的有機(jī)結(jié)合[11],不但具有傳統(tǒng)SBR工藝簡(jiǎn)單、 運(yùn)行維護(hù)方便、 抗沖擊負(fù)荷能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),而且膜的高效截留作用使反應(yīng)器維持較高的污泥濃度,能有效提高氮（high-nitrogen）、 磷和有機(jī)物的去除效果,具有良好的出水水質(zhì)[12,13,14,15].
本研究以Fenton氧化預(yù)處理后的腈綸聚合廢水和丙烯腈廢水為研究對(duì)象,考察了SBMBR對(duì)廢水的處理效能,優(yōu)化了工藝運(yùn)行條件,并采用PCR-DGGE及克隆技術(shù)分析了不同運(yùn)行階段反應(yīng)器內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化,確定了反應(yīng)器運(yùn)行過程中的主導(dǎo)微生物,以期為進(jìn)一步提高腈綸廢水的生化處理效能提供理論參考依據(jù). 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)用水
試驗(yàn)所用的腈綸聚合廢水和丙烯腈廢水取自東北某石化廠,首先將聚合廢水采用Fenton氧化預(yù)處理[10],處理后廢水平均COD由1091 mg ?L-1降至560 mg ?L-1,BOD5/COD由0.32升高至0.69,然后將預(yù)處理后的聚合廢水按1 ∶1的比例與丙烯腈廢水混合,混合后廢水COD為450~600 mg ?L-1,HN+4-N為50~80 mg ?L-1,TN為140~200 mg ?L-1, pH值6.5~8.0.模擬丙烯腈廢水采用葡萄糖、 硫酸銨等配制,同時(shí)加入適量的微量元素液,其COD為340~470 mg ?L-1,HN+4-N為30~60 mg ?L-1.
1.2 試驗(yàn)裝置與運(yùn)行條件
SBMBR反應(yīng)器有效容積為30 L,內(nèi)置3片聚偏氟(fluorine)乙烯平板膜元件,單片有效膜面積為0.1 m2,膜孔徑0.1 μm.反應(yīng)器采用周期運(yùn)行的方式,通過間歇曝氣實(shí)現(xiàn)缺氧/好氧的交替運(yùn)行,曝氣量為600 L ?h-1.反應(yīng)器在進(jìn)入缺氧階段后的前5 min內(nèi)完成進(jìn)水,在好氧階段的最后60 min時(shí)采用間歇式抽吸出水的方式排水,每個(gè)周期出水5.0 L,體積交換比為1 ∶
6. SBMBR的運(yùn)行采用可編程邏輯控制器自動(dòng)控制系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn),反應(yīng)器內(nèi)溫度控制在30℃±1℃.接種污泥取自北京某污水處理廠二沉池回流污泥,初始活性污泥濃度約為3000 mg ?L-1.試驗(yàn)裝置如圖 1所示.
圖 1 試驗(yàn)裝置示意
反應(yīng)器采用逐漸增加實(shí)際廢水比例的方式運(yùn)行,根據(jù)運(yùn)行條件和進(jìn)水水質(zhì)的不同,整個(gè)運(yùn)行期可以分為9個(gè)階段,各階段污泥樣品分別標(biāo)記為S1~S9.反應(yīng)器的運(yùn)行條件見表 1.
表 1 SBMBR不同階段的運(yùn)行條件
1.3 分析方法
1.3.1 生化指標(biāo)
CO
D、 NH+4-
N、 NO-3-
N、 TN均采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[16]; pH值采用pH計(jì)測(cè)定. 1.3.2 PCR-DGGE
采用離心式DNA快速提取試劑盒提取細(xì)菌的總DNA,采用細(xì)菌通用引物8F-G
C、 518R對(duì)總細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)采用50.0 μL的反應(yīng)體系,其組分包括：5.0 μL的10×PCR buffer,4.0 μL的dNTP Mixture,1.0 μL的引物338F,1.0 μL的引物534R,0.25 μL的TaKaRa rTaq,以及2.5 ng的DNA模板.PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性10.0 min,94℃變性1.0 min,55℃退火1.0 min,72℃延伸1.5 min,共循環(huán)30次,最后在72℃條件下延伸10.0 min. DGGE在D-code系統(tǒng)上進(jìn)行,聚丙烯酰胺凝膠濃度為8.0%,變性劑濃度梯度范圍為30.0%~60.0%,電泳電壓為150 V,溫度為60℃,在1×TAE緩沖溶液中電泳420 min,然后采用硝酸銀進(jìn)行染色,利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、 拍照. 1.3.3 克隆測(cè)序
選擇DGGE膠板上含有目的DNA的條帶,用滅菌后的手術(shù)刀切下并迅速轉(zhuǎn)移至離心管中,用滅菌后的刀片將膠塊壓碎,加入30.0 μL ddH2O在4℃條件下溶解24 h,在5000 r ?min-1轉(zhuǎn)速下離心5.0 min,取5.0 μL上清液為模板,采用總細(xì)菌引物8F-GC和518R進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,檢測(cè)回收產(chǎn)物,用QIAquick PCR純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,并送至北京寶杰羅生物工程公司進(jìn)行16S rDNA片段序列測(cè)定. 1.3.4 DGGE圖譜統(tǒng)計(jì)分析
采用Shannon-wiener多樣性指數(shù)H′表征微生物種群多樣性,其計(jì)算公式如下[17]：
式中,Pi=ni/N; ni為第i個(gè)條帶的強(qiáng)度; N為所有條帶強(qiáng)度總和. 2 結(jié)果與討論 2.1 膜生物反應(yīng)器處理效果 2.1.1 連續(xù)運(yùn)行效果
SBMBR不同運(yùn)行階段對(duì)CO
D、 NH+4-N和TN的去除效果見表 2.在反應(yīng)器的啟動(dòng)階段,隨著聚合廢水比例的逐漸增加,COD平均去除率由第I階段的95.5%降低到第Ⅳ階段的87.2%,NH+4-N和TN的平均去除率由第Ⅰ階段的95.9%、 72.7%分別降至48.8%、 60.0%.NH+4-N出水平均濃度由0.8 mg ?L-1升至17.5 mg ?L-1,這主要是由于廢水中的堿度不足,導(dǎo)致硝化反應(yīng)產(chǎn)生大量的酸,SBMBR反應(yīng)器內(nèi)混合液pH值降至6.0以下,使得硝化細(xì)菌的活性受到抑制,導(dǎo)致出水NH+4-N濃度升高[18,19].在第Ⅴ和Ⅵ階段,SBMBR進(jìn)水仍采用1 ∶1的聚合廢水和模擬丙烯腈廢水,并向進(jìn)水中投加0.5 g ?L-1的碳酸氫鈉以增加廢水的堿度.由表 2可以看出,在第Ⅵ階段,進(jìn)水NH+4-N的濃度升至65.3 mg ?L-1,但出水NH+4-N濃度卻降至0.9 mg ?L-1左右,NH+4-N平均去除率迅速升高至98.6%,此時(shí)COD的去除率仍然保持在86.0%左右.這說明在SBMBR處理腈綸廢水的過程中,堿度是限制NH+4-N硝化的最主要的影響因素之一. 從第89 d開始,SBMBR進(jìn)水完全采用實(shí)際廢水,聚合廢水與丙烯腈廢水的比例為1 ∶1.在第Ⅶ階段,反應(yīng)器進(jìn)出水COD平均濃度分別為450.3 mg ?L-1和129.2 mg ?L-1,COD平均去除率由86.3%降至71.1%,但NH+4-N去除率仍保持在97.5%以上.這說明在丙烯腈廢水中存在部分難生物降解有機(jī)物,導(dǎo)致出水COD略有升高,但SBMBR仍然保持較高的NH+4-N去除效率.根據(jù)周期試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果,從第99d開始,調(diào)整每個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)厭氧好氧的時(shí)間為90 min和150 min.在第Ⅷ階段,出水COD和NH+4-N的平均濃度分別為117.3 mg ?L-1和1.7 mg ?L-1,平均去除率分別為71.7%和98.0%,但TN的平均去除率僅為47.4%,這主要是由于進(jìn)水C/N比過低、 微生物缺乏足夠的碳源導(dǎo)致的.在第Ⅸ階段,往進(jìn)水中投加葡萄糖增加碳源,進(jìn)水COD濃度增加至598.2 mg ?L-1,而出水COD濃度則降至105.1 mg ?L-1,NH+4-N濃度則降至1.0 mg ?L-1以下,CO
D、 NH+4-N和TN的平均去除率分別為82.5%、 98.7%和74.6%,出水指標(biāo)可以達(dá)到國(guó)家一級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn).
表 2 SBMBR在不同運(yùn)行階段的主要參數(shù)
同傳統(tǒng)的活性污泥處理工藝相比,SBMBR系統(tǒng)對(duì)廢水COD的去除率更高,這主要?dú)w于以下兩個(gè)原因：一方面,長(zhǎng)期的厭氧/好氧交替環(huán)境馴化出適應(yīng)腈綸廢水特性的微生物種群,這些微生物能夠有效利用廢水中的有機(jī)污染物[20]; 另一方面,SBMBR系統(tǒng)膜分離及膜表面的泥餅有很強(qiáng)的過濾分離能力,能有效濾除廢水中懸浮物、 大分子有機(jī)物和微生物體[21,22],保證了SBMBR系統(tǒng)優(yōu)良且穩(wěn)定的出水水質(zhì).此外,反應(yīng)器運(yùn)行期間平板式膜組件表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗污染能力,在膜通量為16.7 L ?-1,MLSS在6000~6500 mg ?L-1之間,曝氣量為10.0 L ?min-1的運(yùn)行條件下,前60 d跨膜壓差基本上保持在7.5 kPa左右,此后開始逐漸升高,第87 d的時(shí)候TMP達(dá)到27.0 kPa,超過了25.0 kPa的清洗臨界值,取出膜組件采用物理清洗后TMP恢復(fù)至8.0 kPa左右,在之后運(yùn)行的40 d時(shí)間里,TMP沒有出現(xiàn)明顯的升高. 2.1.2 周期試驗(yàn)
序批式生物反應(yīng)器通過間歇曝氣的方式在反應(yīng)器運(yùn)行中實(shí)現(xiàn)缺氧/好氧的交替循環(huán)（continue),最終通過硝化/反硝化過程實(shí)現(xiàn)有機(jī)物和氮的去除,因此,合理的運(yùn)行周期不僅可以提高生化系統(tǒng)的處理效果,還能降低能耗和運(yùn)行成本[23].在反應(yīng)器運(yùn)行的Ⅰ到Ⅶ階段,SBMBR的周期運(yùn)行方式為60 min缺氧/300 min好氧,該條件下單個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)CO
D、 NH+4-
N、 NO-3-N的變化如圖 2所示,可以看出,COD的降解和NO-3-N的去除主要發(fā)生的缺氧攪拌期,這是因?yàn)樵谌毖鯒l件下,異養(yǎng)型的反硝化細(xì)菌（fungus)以廢水中有機(jī)物為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),通過反硝化過程實(shí)現(xiàn)N的去除[24].此外,在缺氧攪拌過程中,系統(tǒng)中NH+4-N的濃度逐漸升高,這主要是廢水中有機(jī)氮在微生物作用下向NH+4-N轉(zhuǎn)化導(dǎo)致(cause)的.在好氧階段,經(jīng)過約90 min的曝氣,NH+4-N濃度迅速降低（reduce)至1.0 mg ?L-1左右,NO-3-N的濃度逐漸升高并在在曝氣210 min左右時(shí)基本達(dá)到最大并穩(wěn)定.為了提高反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)污染物的降解能力,減少過度曝氣帶來的能耗損失,從第99 d開始,調(diào)整SBMBR的運(yùn)行周期為90 min缺氧/150 min好氧,由圖 2可以看出,在該運(yùn)行條件下,COD和NH+4-N都能夠在最經(jīng)濟(jì)的條件下得到有效的去除,出水可以穩(wěn)定達(dá)標(biāo)排放.
圖 2 CO
D、NH4+-N和NO3--N濃度在周期試驗(yàn)中的變化
2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析
2.2.1 總特殊結(jié)構(gòu)：莢膜、鞭毛、菌毛的DGGE圖譜
反應(yīng)器運(yùn)行各階段污泥樣品總細(xì)菌（fungus)的DGGE指紋圖譜見圖 3.從中可以看出,在反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行的9個(gè)階段,各階段污泥樣品的電泳條帶數(shù)目、 條帶強(qiáng)度和條帶遷移速率均存在一定的差異,SBMBR系統(tǒng)中微生物種群呈現(xiàn)出較為明顯的演替變化.在反應(yīng)器運(yùn)行的初始階段,污泥的培養(yǎng)馴化還未完成,污泥樣品的條帶數(shù)目較少,說明微生物種群結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單.隨著實(shí)際廢水比例的不斷增加和污泥的馴化,污泥樣品的條帶數(shù)目開始逐漸增多,條帶分布也較為均勻,說明微生物種群組成開始變得更加豐富（plump),反應(yīng)器的穩(wěn)定性也在不斷增強(qiáng).從S7開始,由于采用了實(shí)際丙烯腈廢水代替之前的模擬廢水,進(jìn)水水質(zhì)發(fā)生了明顯的變化,微生物種群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了較為明顯的變化,部分菌種的條帶強(qiáng)度略有降低,并產(chǎn)生了一些新的條帶,說明不適應(yīng)進(jìn)水水質(zhì)的微生物群落優(yōu)勢(shì)度降低,降解實(shí)際廢水中污染物的新菌群逐步建立并形成為優(yōu)勢(shì)菌種.S9樣品泳道中條帶較為豐富、 均勻度較好,說明反應(yīng)器經(jīng)過一個(gè)階段的運(yùn)行后,微生物群落逐漸豐富并達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài).
圖 3 SBMBR污泥總細(xì)菌的DGGE指紋圖譜
采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)相似性作聚類分析,結(jié)果如圖 4所示.從中可以看出,9個(gè)樣品的微生物群落可以分成3大族群,樣品1、 2為一個(gè)族群,樣品3、
4、 5為一個(gè)族群,樣品6、
7、
8、 9為一個(gè)較大的族群,這說明隨著反應(yīng)器運(yùn)行條件的不同和進(jìn)水水質(zhì)的變化,污泥微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化.在完全采用實(shí)際廢水處理后,污泥樣品的群落結(jié)構(gòu)與之前采用部分模擬廢水時(shí)的群落結(jié)構(gòu)存在較為明顯的變化.
圖 4 SBMBR中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析
2.2.2 總細(xì)菌多樣性指數(shù)
采用Shannon-wiener多樣性指數(shù)表征總細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性,結(jié)果見圖 5.在S1~S4,隨著聚合廢水比例的逐漸增加,在廢水特征污染物的選擇作用下,一些不適應(yīng)聚合廢水的微生物生長(zhǎng)處于劣勢(shì),微生物種群數(shù)量減少,生物多樣性指數(shù)略有下降,而隨著新的微生物種群結(jié)構(gòu)的建立和微生物對(duì)水質(zhì)和外部環(huán)境的逐漸適應(yīng),細(xì)菌種類和數(shù)量又開始增加,生物多樣性指數(shù)上升,在S4時(shí)達(dá)到了一個(gè)較高的水平.從S5開始,由于調(diào)整了進(jìn)水堿度和pH,微生物群落結(jié)構(gòu)受到外部環(huán)境變化影響,微生物多樣性指數(shù)出現(xiàn)小幅降低,而在之后的一段時(shí)間內(nèi),反應(yīng)器pH值始終維持在7.5~8.5之間,進(jìn)水的水質(zhì)也基本趨于穩(wěn)定,微生物的生長(zhǎng)條件比較適宜,新的微生物種群結(jié)構(gòu)逐漸建立,S9的微生物的多樣性指數(shù)達(dá)到了最大.
圖 5 SBMBR微生物多樣性指數(shù)
2.2.3 優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定
對(duì)DGGE指紋圖譜的條帶進(jìn)行回收測(cè)序分析,將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì),確定各微生物的同源性及種屬,檢測(cè)到的微生物及其相關(guān)信息如表 3所示.經(jīng)比對(duì)鑒定(同義詞:判定、判斷、判決),在SBMBR的9個(gè)污泥樣品中共檢測(cè)到22種微生物,其相似度大多在98%以上,其中屬于變形菌Proteobacterium的微生物有12種,分別屬于α綱和γ綱,其余10種屬于未分類的Bacterium.
在反應(yīng)器運(yùn)行不同階段,DGGE指紋圖譜中的條帶強(qiáng)度和優(yōu)勢(shì)菌種也在不斷變化,各菌種的功能也不盡相同.Uncultured bacterium clone S2-42和Uncultured bacterium clone AS_bH9主要與氨氮的硝化過程有關(guān)[25]; Klebsiella pneumoniae strain 27F主要與醇類物質(zhì)的降解過程有關(guān)[26]; Uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium檢出于受石油污染的土壤,與甲苯的降解過程有密切的關(guān)系[27].另外,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)描述,Sphingomonas sp. EMBS051發(fā)現(xiàn)于染料廢水的生物降解過程中,與廢水中大分子芳香族化合物的降解過程有關(guān); Uncultured bacterium clone PAE-49與氨氮的硝化過程有關(guān); Uncultured bacterium clone WT14H7和Uncultured bacterium clone WT14H9發(fā)現(xiàn)于吡啶的堆肥降解過程中,可能與腈綸廢水中某些類似含氮雜環(huán)有機(jī)物的降解過程有關(guān).
表 3 SBMBR中優(yōu)勢(shì)菌條帶測(cè)序結(jié)果
在處理實(shí)際腈綸廢水的最后3個(gè)階段,反應(yīng)器內(nèi)優(yōu)勢(shì)微生物主要有：Uncultured bacterium clone F49 、 Uncultured bacterium clone S2-42 、 Sphingomonas sp. EMBS051 、 Uncultured bacterium clone AS_bH9 、 Uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium 、 Uncultured bacterium clone PAE-49 、 Uncultured bacterium clone WT14H7 ,這7種微生物在降解腈綸廢水污染物的過程(guò chéng)中起著重要作用,是保證生化處理單元效果和反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的重要保證.然而,這些微生物多為未培養(yǎng)的微生物,且腈綸廢水的污染物組成十分復(fù)雜,要具體了解這些微生物在反應(yīng)器中的功能,以及它們與特定污染物降解之間的關(guān)系,還需要做更細(xì)致、 更深入的研究. 具體參見污水寶商城資料或
3 結(jié)論
SBMBR處理Fenton預(yù)處理后的腈綸聚合廢水和丙烯腈廢水,在廢水比例為1 ∶1、 HRT為24
H、 缺氧90 min/好氧150 min交替運(yùn)行條件下,出水COD和NH+4-N濃度分別為105 mg ?L-1和0.9 mg ?L-1,出水水質(zhì)可以穩(wěn)定達(dá)到國(guó)家污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn).
堿度和碳源不足是限制脫氮效能的主要影響因素,堿度不足影響NH+4-N的硝化反應(yīng),碳源不足影響TN的去除效果,增加進(jìn)水碳源可以顯著提高TN的去除效率(efficiency).
PCR-DGGE分析表明,反應(yīng)器內(nèi)微生物(Micro-Organism)多樣性與進(jìn)水水質(zhì)和運(yùn)行條件密切相關(guān),反應(yīng)器運(yùn)行期間微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的演替過程(guò chéng),生化系統(tǒng)完全穩(wěn)定后,微生物多樣性指數(shù)達(dá)到最大.
通過克隆測(cè)序，從9個(gè)運(yùn)行階段的污泥樣品中成功鑒定獲得22種微生物的16S rDNA序列,并篩選出7種降解腈綸廢水的優(yōu)勢(shì)微生物,為腈綸廢水生化處理的深入研究（research)提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)資料.
