X、Dechloromonas和Sulfuritalea.
硫化物具有強烈的毒性和臭味，它的超標排放是目前面臨的嚴峻的環(huán)境問題之一.它能夠和細胞色素中的金屬離子進行反應(yīng)，進而抑制細胞的呼吸作用.此外，它還具有腐蝕性并產(chǎn)生很高的化學(xué)需氧量.硫化物通常在產(chǎn)甲烷的過程中伴隨產(chǎn)生，它也產(chǎn)生于多種工業(yè)加工過程，例如：石油化工(petrochemical industry)、造紙、制革等.許多物理、化學(xué)和電化學(xué)方法已經(jīng)用來處理氣體和水中的硫化物，例如：沉淀法、氣提、離子交換、電催化氧化（oxidation)、有機溶劑和化學(xué)氧化.其中，利用無色硫細菌的生物處理技術(shù)具有低成本、低能耗和產(chǎn)物無害等優(yōu)勢（解釋:能壓倒對方的有利形勢).因此，它是一種國際上日益關(guān)注的熱門技術(shù).Thiobacillus denitrificans被發(fā)現(xiàn)能夠利用無機硫化合物作為能量來源，無機碳化合物作為碳源進行生長.左劍惡等在升流式生物膜反應(yīng)器中，利用無色硫細菌處理廢水中的硫化物，去除率為90%，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率為100%.這類能夠利用無機硫化合物的自養(yǎng)反硝化細菌具有較高的研究價值，因為它在反硝化過程中不需要再額外添加有機碳源并節(jié)約經(jīng)濟成本.相關(guān)技術(shù)目前已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，例如：市政污水、地表水和垃圾滲濾液的處理.
近年來，多單元聯(lián)合生物技術(shù)快速發(fā)展并應(yīng)用于處理含有碳、氮和硫系化合物的廢水.此技術(shù)的過程原理為：厭氧發(fā)酵階段硫酸鹽還原所產(chǎn)生的硫化物及少量剩余COD在反硝化單元被來自硝化單元的硝酸鹽氧化去除.在香港特別行政區(qū)，應(yīng)用此技術(shù)已經(jīng)成功建立了示范工程，主要進行沿海地區(qū)高硫酸鹽生活污水的脫氮處理.脫氮單元中的活性污泥通常含有自養(yǎng)和異養(yǎng)反硝化細菌，其中有些物種能夠利用含硫化合物還原硝化單元所產(chǎn)生的硝酸鹽.除能以含硫化合物作為能源的自養(yǎng)反硝化細菌以外，一些異養(yǎng)細菌也被發(fā)現(xiàn)具有這樣的功能.它們能夠利用硫化物和硝酸鹽進行呼吸作用，并產(chǎn)生單質(zhì)硫和氮氣作為反應(yīng)產(chǎn)物.這種生物基單質(zhì)硫具有親水的特性，能夠作為生產(chǎn)肥料和殺蟲劑的原料，具有較高經(jīng)濟價值.
本研究分離1株能夠利用硝酸鹽作為電子受體，乙酸鹽和硫化物作為電子供體進行生長代謝的細菌.在硫化物氧化過程中，單質(zhì)硫為主要的反應(yīng)產(chǎn)物.已有的研究結(jié)果顯示Thauera屬的物種是污水處理系統(tǒng)中最活躍的反硝化細菌，但是其硫氧化的生理特性極少有研究報道.本研究揭示菌株HDD1在生態(tài)學(xué)以及污水處理技術(shù)應(yīng)用中的重要意義.
1 材料與方法1.1 菌株分離與培養(yǎng)條件
活性污泥來源于實驗室運行的污水處理生物反應(yīng)器.分離培養(yǎng)基包括以下物質(zhì)：Na2S?9H2O，1.5;CH3COONa，0.387 5;KNO3，0.757 5;NH4Cl，1.0;KH2PO4，1.8;Na2HPO4?12H2O，3.0;MgSO4?7H2O，0.1;Agar，1.5.培養(yǎng)基滅菌后加入過濾滅菌的微量元素(trace element)液.采用亨蓋特厭氧培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合稀釋滅絕法進行菌株的分離和純化.活性污泥經(jīng)過梯度稀釋以后，接種到含有固體培養(yǎng)基的厭氧管中.在30℃條件下靜置培養(yǎng)7 d后，單克隆被接種到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng).液體培養(yǎng)基經(jīng)過煮沸和充入氬氣達到厭氧條件，加入L-半胱氨酸和1 mL濃度為0.2%的刃天青作為除氧劑和指示劑.通過(tōng guò)在固-液分離培養(yǎng)基中反復(fù)轉(zhuǎn)接得到細菌培養(yǎng)物.通過顯微鏡觀察和16S rRNA基因測序技術(shù)檢測其是否為純培養(yǎng).
1.2 菌株鑒定
采用Bacterial DNA Mini Kit 提取特殊結(jié)構(gòu)：莢膜、鞭毛、菌毛基因組DNA.提取的基因組DNA經(jīng)分光光度計定量后作為聚合酶鏈式反應(yīng)的模板.采用細菌16S rRNA基因通用引物F27和R1492進行擴增反應(yīng).反應(yīng)體系包括Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix ，濃度為20 μmol?L-1的上下游引物，20 ng DNA模板和蒸餾水.采用GeneAmp PCR system 進行擴增反應(yīng)，具體步驟設(shè)置如下：94℃起始變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán).擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后，用BLAST-N程序和原核生物數(shù)據(jù)庫進行比對分析.利用MEGA 5.0軟件包，采用鄰位相連算法構(gòu)建系統(tǒng)(system)進化樹.進化樹的拓撲結(jié)構(gòu)經(jīng)過1 000次引導(dǎo)重復(fù)取樣檢驗.
1.3 生理學(xué)和化學(xué)分析
細菌經(jīng)離心收集后，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，用2.5%戊二醛固定30min.用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇（chún）脫水后，以飽和叔丁醇做介質(zhì)進行真空干燥.利用掃描電子顯微鏡觀察細胞形態(tài).利用生化試劑條檢測菌株的生理特征.細胞經(jīng)過標準革蘭氏染色后，用氫氧化鉀(Potassium)消散法復(fù)檢[25].菌體蛋白濃度測定采用Bradford Protein Assay Kit 的標準方法.CH3COO-、NO3-、NO2-、SO42-和S2O32-的濃度由離子色譜測定.S2-的測定采用標準亞甲基藍分光光度法.利用能量散射譜儀測定單質(zhì)硫及其含量.菌株的16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為KX242545.
2 結(jié)果與分析2.1 菌株的分離與鑒定
經(jīng)過5輪固-液分離培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，得到菌株HDD1.在顯微鏡視野下，細菌的形態(tài)呈統(tǒng)一的桿狀;16S rRNA基因測序結(jié)果中不存在噪聲信號，這表明菌株HDD1為純培養(yǎng).提交長度為1 397bp的16S rRNA基因序列到數(shù)據(jù)庫進行比對分析，結(jié)果顯示HDD1與Thauera aminoaromatica S2的相似度最高，達到98.7%.進化樹結(jié)果顯示HDD1在Thauera屬中形成一個單源的進化枝，并與Thauera humireducens和Thauera terpenica形成一個進化群.用最大似然算法對系統(tǒng)進化樹驗證，得到相同結(jié)果.這些結(jié)果表明菌株HDD1可能是Thauera屬的一個新種，但是還需多相分類結(jié)果進行驗證.
圖 1 鄰位相連法構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹
2.2 菌株的生理特性
菌（fungus)株HDD1革蘭氏染色呈陰性，細胞呈桿狀.反硝化作用、吲哚反應(yīng)和有機酸同化作用呈陽性;糖類水解酸化反應(yīng)呈陰性.通常Thauera屬的各個種是一類兼性厭氧，專性進行呼吸作用的細菌.它們能夠利用氧氣、氮氧化物作為電子受體，在好氧呼吸和反硝化作用之間轉(zhuǎn)化代謝狀態(tài).有些種在厭氧條件下可以還原硒酸鹽.很多種能夠利用有機酸、氨基酸、芳香和脂肪(fat)類化合物進行生長.它們通常在污水處理廠、江河、池塘沉積（sedimentation)物等被污染的地區(qū)被發(fā)現(xiàn).菌株HDD1的生理特征結(jié)果和伯杰氏系統(tǒng)微生物學(xué)手冊中Thauera屬的描述相同.
圖 2 菌株HDD1掃描電子顯微鏡圖像
表 1 菌株HDD1的生理學(xué)特性
2.3 菌株的代謝特性
菌株HDD1在厭氧條件下利用硝酸鹽作為電子受體氧化乙酸鹽和硫化物.在15 h之內(nèi)，CH3COO-基本被完全代謝，其濃度由300 mg?L-1下降到20 mg?L-1，菌體蛋白濃度由1.5 μg?mL-1上升到11 μg?mL-1[圖 3]，生物量有所增加;NO3-濃度由487 mg?L-1下降到38 mg?L-1，NO2-在第15~20 h之間有短暫的積累，最高濃度為67.7 mg?L-1 [圖 3];濃度為200 mg?L-1的S2-被完全代謝，S2O32-和SO42-的濃度略有上升[圖 3].S2O32-和SO42-的背景值可能是由于在滅菌過程中發(fā)生輕微的氧化導(dǎo)致的.在0~5 h，CH3COO-濃度快速地由300 mg?L-1下降到128 mg?L-1，菌體蛋白濃度由1.5 μg?mL-1上升到5.7 μg?mL-1.在代謝反應(yīng)初期，活化細菌直接進入對數(shù)生長期，生物量快速增加，CH3COO-濃度相應(yīng)地快速下降.在此階段，NO3-作為電子受體并沒有相應(yīng)地大幅減少.這是由于在對數(shù)生長期，大部分CH3COO-通過同化作用直接合成細胞物質(zhì)，只有少部分通過與NO3-耦合進行呼吸作用.進入穩(wěn)定（解釋:穩(wěn)固安定；沒有變動)期和衰亡期后，細菌同化作用速率減小，需要產(chǎn)生大量能量維持細胞的生命活動.CH3COO-和S2-作為電子供體耦合NO3-進行呼吸作用，大部分NO3-被代謝消耗.為了限制S2-過度氧化成S2O32-和SO42-，增加單質(zhì)硫的產(chǎn)量，電子受體NO3-濃度的初始設(shè)置較低.它也是工藝實際運行過程中一個重要的參數(shù)，根據(jù)進水COD含量和活性污泥狀態(tài)而進行調(diào)整.隨著硫化物被逐漸氧化，所形成的單質(zhì)硫逐漸聚集成為直徑不同的顆粒[圖 4].這些顆粒主要是由
C、
O、S和P等元素組成.其中S元素占總含量的20%;由于樣品中存在菌體等有機物，C元素占總量的68.6%;由于培養(yǎng)基中存在磷酸鹽等物質(zhì)，O元素和P元素分別占總含量的9.2%和2.1%[圖 4].由于S2O32-和SO42-含量很低，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)元素平衡原理，硫化物氧化的主要產(chǎn)物為單質(zhì)硫.硫酸鹽被還原成硫化物，硫化物再被氧化，是硫元素生物地球化（退火工藝)學(xué)循環(huán)中重要的過程.這個過程涉及到多種復(fù)雜的反應(yīng)、硫細菌和酶.無色硫細菌分為4個系統(tǒng)進化世系，3個屬于細菌域，1個屬于古細菌域.多數(shù)的無色硫細菌屬于Proteobacteria門的Gammaproteobacteria綱.根據(jù)碳源和能量代謝方式，無色硫細菌可以分為不同的生理類型，包括：專性化能無機營養(yǎng)型、兼性化能無機營養(yǎng)型、化能無機異養(yǎng)型和化能有機異養(yǎng)型.化能無機異養(yǎng)型是指能夠利用還原性含硫化合物作為能量來源，但是不能固定二氧化碳的細菌.根據(jù)生理學(xué)特性，菌株HDD1不能利用光能，且只能利用乙酸鹽等有機物作為碳源，所以它屬于化能異養(yǎng)型微生物.在氧化硫化物過程中其是否獲得能量還需進一步驗證.原位檢測技術(shù)結(jié)果顯示Thauera屬在污水處理系統(tǒng)中是一類活躍的反硝化細菌，但是很少有研究報道它們的硫氧化功能.微生物群落分析表明Thauera屬在反應(yīng)器的生態(tài)系統(tǒng)中具有很高的豐度，但是由于缺乏菌株的純培養(yǎng)，深入的生理學(xué)特征研究很難開展.在生理學(xué)研究中，菌株HDD1可以作為研究Thauera屬硫氧化功能的模式種為進一步的研究提供基礎(chǔ);在生態(tài)學(xué)研究中，它的相關(guān)功能基因可以作為分子標記，為搜索復(fù)雜群落中的功能微生物提供技術(shù)支撐.目前，造紙廠、煤氣廠和制藥廠等工業(yè)廢水都含有大量的硫化物.生物法短程氧化硫化物并回收單質(zhì)硫作為資源具備很多優(yōu)勢.首先，它是化學(xué)和化肥工業(yè)的原料.其次，和物理化學(xué)法相比，生物法更加節(jié)約能源和成本.分離并研究功能菌株的生理學(xué)特性是這項生物技術(shù)應(yīng)用的重要保障.在這項技術(shù)中，菌株HDD1和其他常見的硫氧化細菌，例如：Thiobacillus denitrificans和Paracoccus denitrificans起到關(guān)鍵作用并有待更深入地研究.具體參見污水寶商城資料或
圖 3 菌株HDD1的碳氮硫（化學(xué)符號：S）化合物代謝
掃描電子顯微鏡圖像;能量色散譜分析圖 4 菌株HDD1代謝產(chǎn)物分析
3 結(jié)論
在本研究（research)中，從反應(yīng)器活性污泥中分離純化出1株特殊結(jié)構(gòu)：莢膜、鞭毛、菌毛HDD1.基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進化分析顯示，它與Thauera屬的物種具有親緣關(guān)系并形成一個單源的進化枝.生理特征實驗結(jié)果驗證表明菌株HDD1是Thauera屬的一個種.菌株HDD1能夠利用硝酸鹽作為電子受體同步氧化硫（化學(xué)符號：S）化物和乙酸鹽.在15 h之內(nèi)，濃度為300 mg?L-1的CH3COO-、200 mg?L-1的S2-和487 mg?L-1的NO3-被完全代謝去除.根據(jù)其特殊的生理特征，菌株HDD1可以同時應(yīng)用于處理含有碳(C)、氮、硫系化合物的工業(yè)廢水及硫元素的資源化回收.
