鑒于此，本研究首先采用454焦磷酸測序技術(shù)，分析二級出水中微生物群落結(jié)構(gòu)特性，揭示二級出水中常見的幾種病原菌; 然后采用培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR方法考察了紫外消毒對該污水廠二級除水中指示菌和病原菌的去除特性，以期為污水回用中病原菌的去除工藝提供一些參考，保障污水回用的衛(wèi)生學(xué)安全.
1 材料與方法
1.1 樣品采集及實(shí)驗(yàn)（experiment)設(shè)置
本研究樣品采自南方某生活污水處理廠二級出水，該廠采用傳統(tǒng)活性污泥法，二級處理采用空氣曝氣活性污泥法，該廠進(jìn)水與出水的水質(zhì)參數(shù)情況如表 1所示. 二級出水的取樣體積為5 L. 樣品取好后放置于采樣箱中，于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，1 L水樣用于群落結(jié)構(gòu)分析. 共采樣5次.
表 1 本實(shí)驗(yàn)（experiment)用再生水的水質(zhì)參數(shù)
紫外消毒對病原菌的影響在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行. 紫外輻射(Radiation)采用超凈臺中的紫外燈管進(jìn)行. 經(jīng)紫外輻射計測定，本研究采用的紫外燈管對實(shí)驗(yàn)中水樣放置區(qū)域的紫外照射強(qiáng)度均勻. 實(shí)驗(yàn)中采用校準(zhǔn)的紫外輻射計對玻璃杯處的紫外強(qiáng)度為 0.1mW ?cm-
2. 將1.5 L水樣倒入2L燒杯中，放入磁性轉(zhuǎn)子（rotor），將燒杯放在磁力攪拌器上，打開超凈臺的紫外燈，使得水樣接受紫外照射. 實(shí)驗(yàn)所需的紫外線劑量=紫外線強(qiáng)度×照射時間.
《城鎮(zhèn)給排水紫外線消毒設(shè)備》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：城鎮(zhèn)生活飲用水的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為40 mJ ?cm-2，中水回用的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為80 mJ ?cm-2，城鎮(zhèn)污水的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為15 mJ ?cm-2，城鎮(zhèn)污水的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為20 mJ ?cm-
2. 紫外線消毒設(shè)備應(yīng)用于城市雜用水、 景觀環(huán)境用水時，應(yīng)分別達(dá)到GB-T 18920和GB-T 50335中的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)要求. 再生水作為景觀環(huán)境用水時糞大腸菌群要求小于200 CFU ?L-
1. 本研究中，設(shè)定紫外線劑量20、 40、 60、 80 mJ ?cm-2時，分別用培養(yǎng)法檢測糞大腸菌群的濃度水平，考察不同紫外劑量對本樣品中微生物的去除水平，以選擇合適的紫外劑量.
經(jīng)選擇，考慮經(jīng)濟(jì)(jīng jì)成本，最終設(shè)定紫外線劑量為60mJ ?cm-2，即照射時間為10 min. 照射后在黑暗條件下放置12 h. 本實(shí)驗(yàn)在室溫環(huán)境下進(jìn)行，反應(yīng)終止后采用培養(yǎng)法和qPCR及Q-RT-PCR檢測消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度.
1.2 二級出水中微生物多樣性分析
1.2.1 DNA的提取
將1L水樣經(jīng)醋酸纖維素濾膜過濾，將過濾下的物質(zhì)于濾膜一同轉(zhuǎn)入15 mL無菌離心管中，加入10 mL滅菌后的PBS在漩渦振蕩器上洗脫過濾截留的顆粒物. 將濾膜取出，離心管置于4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)為10 000 r ?min-
1. 棄去上清液，將底部物質(zhì)轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，于4℃離心5 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r ?min-
1. 棄去上清液，管內(nèi)留500 μL液體進(jìn)行DNA的提取. DNA提取采用FastDNA@ Spin Kit for Soil試劑盒，具體操作過程按說明書進(jìn)行. 最后得到DNA體積為50 μL.對得到的DNA進(jìn)行純化，采用Universal DNA 純化回收試劑盒. 提取后的DNA用于454焦磷酸測序.
1.2.2 PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榧?xì)菌16S rRNA的V1-V3區(qū)，擴(kuò)增長度為500 bp. 上游引物為：27F：5′- 融合 A-標(biāo)簽-CA接頭-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物為：533R：5′- 融合 B-TC 接頭-TTACCGCGG CTGCTGGCAC-3′. 為了區(qū)分同一體系中的不同樣品，在引物前端加入一個10 bp的標(biāo)簽. PCR反應(yīng)體系為50 μL：5×FastPfu Buffer 10 μL; 2.5 μmol ?L-1 dNTPs 5 μL; 5 μmol ?L-1上下游引物2 μL; FastPfu Polymerase 1 μL; DNA模板100-200 ng; 其余用雙蒸水補(bǔ)足50 μL. PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋合?5℃ 2 min; 然后進(jìn)行30個循環(huán),最后72℃ 10 min. 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳在500 bp位置處檢測到條帶，將PCR產(chǎn)物用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物. 采用分光光度計測定DNA的濃度及質(zhì)量.
1.2.3 454文庫構(gòu)建和測序
應(yīng)用高通量測序平臺GS 454 FLX Titanium對標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序. 測序完成后對所得序列進(jìn)行處理，處理原則如下：
?、贆z測標(biāo)簽的完整性，棄去標(biāo)簽不完整的序列;
?、跅壢テ伍L度低于200 bp的序列;
?、酆Y除尾部質(zhì)量數(shù)低于20的末端序列;
?、鼙ＷC每個樣品系列中80%以上堿基的序列質(zhì)量數(shù)大于20[10].
1.2.4 測序結(jié)果分析及分類學(xué)分析
對1.2.3節(jié)得到的有效序列比對至SILVA數(shù)據(jù)庫的16S rRNA序列上，去除目標(biāo)區(qū)域以外的序列. 利用mothur軟件，根據(jù)每組中的重復(fù)（repeat)序列，去除嵌合體序列，通過對RDP數(shù)據(jù)庫中的PDS序列進(jìn)行比對，排除（Remove)葉綠體、 線粒體、 古細(xì)菌、 真核序列的干擾. 根據(jù)序列的相似性，將之歸為多個OUT. 選擇相似水平為0.03的進(jìn)行后續(xù)分析(Analyse),構(gòu)建稀疏曲線. 利用mothur軟件計算樣本的Chao豐度指數(shù)，Shannon多樣性指數(shù)，Simpson多樣性指數(shù)，覆蓋度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù).
1.3 細(xì)菌的檢測 本研究中選擇常用的指示菌大腸桿菌作為目標(biāo)指示菌. 對測序結(jié)果進(jìn)行分析，最終選擇沙門氏菌和分枝桿菌作為待檢測的病原菌. 分別采用培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR方法檢測水樣中細(xì)菌的濃度水平.
1.3.1 培養(yǎng)法
大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的培養(yǎng)法檢測參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行.
1.3.2 DNA提取
消毒前病原菌的分析采用1.2.1節(jié)提取得到的DNA. 消毒后濃縮1L待測樣品，提取過程按照1.2.1節(jié)進(jìn)行.
1.3.3 qPCR
qPCR引物及探針的選擇
本研究中大腸桿菌和分枝桿菌的qPCR檢測采用SYBR® Green qPCR. 采用Taqman® qPCR定量檢測沙門氏菌. 所采用的目的基因和相應(yīng)引物序列見表 2.
表 2 定量PCR采用的目的基因和相應(yīng)引物序列
qPCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備
標(biāo)準(zhǔn)品采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，制作方法參見文獻(xiàn)[15]，制備含有uid
A、 invA和hsp65基因的質(zhì)粒DNA.
大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建過程中采用大腸桿菌和與uidA基因相應(yīng)的引物，沙門氏菌和與invA基因相應(yīng)的引物，分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建采用分枝桿菌和hsp65基因相應(yīng)的引物，目標(biāo)基因經(jīng)PCR擴(kuò)增之后將特異性產(chǎn)物連接入pCR 2.1-TOPO載體 中，經(jīng)過酶切鑒定測序分析和質(zhì)粒提取等步驟獲得大腸桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品. 采用核酸蛋白儀測量DNA的濃度. 將得到的質(zhì)粒DNA按10倍梯度稀釋，制得qPCR標(biāo)準(zhǔn)品.
qPCR測定
大腸桿菌及分枝桿菌qPCR反應(yīng)體系為：SYBR® Premix Ex TaqTM 10 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA5 μL，雙蒸水4 μL. 沙門細(xì)菌qPCR反應(yīng)體系為：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，Taqman® 熒光探針1 μL，DNA5 μL，雙蒸水1.5 μL補(bǔ)足體積至25 μL.
大腸桿菌反應(yīng)程序如下：1個循環(huán)：95℃，1 min; 40個循環(huán)：95℃，20 s; 60℃，20 s; 72℃，15 s; 熔解曲線的過程為：95℃，1 min，從60℃開始每30 s溫度升高0.5℃，總共進(jìn)行71個循環(huán)，結(jié)束溫度為95℃，反應(yīng)結(jié)束之后4℃保存.
沙門氏菌反應(yīng)程序如下：1個循環(huán)：95℃，10 min; 40個循環(huán)：95℃，20 s; 60℃，30 s; 72℃，25 s; 不設(shè)置熔解曲線，反應(yīng)結(jié)束之后4℃保存.
分枝桿菌反應(yīng)程序如下：1個循環(huán)：94℃，1 min; 40個循環(huán)：94℃，60 s; 60℃，60 s; 72℃ 60 s; 熔解曲線過程為同大腸桿菌.
每次定量PCR反應(yīng)都設(shè)空白對照，每次測定設(shè)2個平行樣.
1.3.4 Q-RT-PCR
Q-RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備參考文獻(xiàn)[7].
樣品的濃縮參照1.2.
1. RNA的提取采用Fast RNA® Pro Soil-Direct Kit.
2 結(jié)果與討論 2.1 二級出水中微生物群落結(jié)構(gòu)組成 2.1.1 微生物多樣性分析
通過對5個批次樣品16S rRNA基因文庫進(jìn)行焦磷酸測序，經(jīng)修剪去雜后，共獲得1 128、 1 299、 1 292、 1 019和1 462條優(yōu)化序列，序列平均長度為545 bp. 將優(yōu)化序列截齊后與SILVA比對后進(jìn)行聚類，在97%相似性下分別獲得252、 264、 375、 315和554 OTUs，稀疏曲線如圖 1所示. 從中可知，當(dāng)測序數(shù)量超過1 000時，仍有新的OUT可被測出. 稀疏曲線隨測序序列增加趨向平坦，表明本研究樣本取樣量合理. 表 3列出了α多樣性分析各樣品的多樣性指數(shù).
圖 1 二級出水樣品的稀疏曲線
表 3 二級出水中微生物物種豐富（plump)度和多樣性評價
對測序結(jié)果進(jìn)行門的組成進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖 2所示. 相似性為97%時，樣品中共檢測到21個門，包括酸桿菌門、 放線菌門、 、 擬桿菌門、 綠彎菌門、 藍(lán)細(xì)菌門、 Deinococcus-Thermu
S、 厚壁菌門、 梭桿菌門、 Gemmatimonadet
E、 硝化螺旋菌門、 浮霉菌門、 變形菌門、 螺旋菌門、 互養(yǎng)菌門和疣微菌門. 樣品中有794條序列不能被分入已知菌門，這些細(xì)菌可能是未知菌種.
圖 2 樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門比例組成
由圖 2可知，樣品中包括藍(lán)細(xì)菌門、 擬桿菌門、 厚壁菌門、 變形菌門這4個主要門及未定菌和其它未分類菌. Ye等[16]在研究香港一座采用活性污泥法的污水廠微生物群落結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，污水廠二級出水中變形菌門是最主要的細(xì)菌群. Lee等[17]在研究首爾不同污水廠進(jìn)水及活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)中同樣也發(fā)現(xiàn)，變形菌門、 擬桿菌門及厚壁菌門是依次最主要的3個細(xì)菌群. Shu等[18]在研究陜西6座污水處理廠厭氧消化污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)中，也得到了同樣的結(jié)論，變形菌門、 擬桿菌門、綠彎菌門及厚壁菌門是依次主要的4個細(xì)菌群. 本研究得到的結(jié)論與這些研究結(jié)果相一致.
對兩個主要門變形菌門和擬桿菌門進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖 3所示.
由圖 3可知，變形菌門主要由α-、 β-和γ-Proteobacteria這3個主要亞綱組成，分別為23.9%、 43.5%和12.9%. 值得注意的是β-Proteobacteria亞綱包含許多種類的致病菌，在本研究中也檢測到. 由圖 3可知，擬桿菌門主要由Flavobacteri
A、 Sphingobacteria和Bacteroidia這3個主要綱組成，分別為79.5%、 11.6%和2.5%. 上述研究結(jié)果與Hu等[10]的研究結(jié)果相一致.
圖 3 樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)綱水平比例組成
2.1.2 主要病原菌解析（analysis 剖析；深入分析)
病原菌的去除是保障污水回用衛(wèi)生學(xué)安全的重要組成. 綜合國內(nèi)外研究病原菌分類[19, 20]，本研究共發(fā)現(xiàn)11種病原菌，其中梭菌屬、 弓形桿菌屬和分支桿菌的包含比重較高，此外常見的病原菌埃希氏菌和志賀氏菌和軍團(tuán)菌也均檢測到. 弓形桿菌屬是革蘭氏陰性螺旋形微生物，屬于彎曲桿菌科[21]，會引起腹瀉、 腹痛等癥狀. 對一些消毒劑的耐受性較強(qiáng)，在深度處理過程中較難去除[22]. 分枝桿菌屬大部分種類是機(jī)會致病菌，可能會引起系列人類感染疾病[23]. 分枝桿菌是革蘭氏陽性菌，其特殊的生理性能使得其對各種消毒劑具有較好的抗性[24]. 此外，該細(xì)菌可以寄生于阿米巴蟲身上，進(jìn)一步增強(qiáng)了他們的耐消毒性[25]. 在污水回用中需采用別的處理方法進(jìn)行去除. 梭菌屬是革蘭氏陽性菌，在污水處理廠中普遍存在[19]，會引起破傷風(fēng)等各類疾病. 梭菌屬為專性厭氧微生物，能形成孢子，使其對氧化性消毒劑具有極強(qiáng)的耐受性[26]. 但是，梭菌屬對紫外消毒則較為敏感[27, 28]，這主要由于紫外消毒并不是通過氧化作用破外細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而是直接導(dǎo)致核酸突變，阻礙其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，封鎖及阻礙蛋白質(zhì)的合成同時產(chǎn)生的自由基可引起光電離，最終導(dǎo)致微生物死亡[29, 30]. 不同病原菌的生理特性不同，在深度處理過程中應(yīng)結(jié)合不同病原菌的生理特性設(shè)置處理來去除污水中的病原菌.
表 4 樣品中各病原菌比例
2.2 紫外消毒對指示菌與病源菌的殺滅特性細(xì)菌的影響
不同紫外劑量下，大腸桿菌的篩除效果如圖 4所示. 從中可知，當(dāng)紫外劑量為60 mJ ?cm-2時，對大腸桿菌的去除率達(dá)到3.2個數(shù)量級，出水濃度為113 CFU ?L-1可以滿足再生水用作景觀用水時的衛(wèi)生學(xué)要求. 因此，本研究考察紫外劑量為60 mJ ?cm-2對不同病原菌的去除效果.
圖 4 大腸桿菌的紫外消毒曲線
本研究（research)中qPCR的線性檢測區(qū)間如下：大腸桿菌為3×102～3×108 copies ?reaction-1; 沙門氏菌為6×102～6×108 copiese ?reaction-1; 分枝桿菌為8×101～8×108 copies ?reaction-
1. 大腸桿菌、 沙門氏菌與分枝桿菌的線性相關(guān)系數(shù)均>0.99，PCR擴(kuò)增效率在95%-110%之間. 大腸桿菌及分枝桿菌的熔解曲線呈現(xiàn)單一的熔點(diǎn)峰，峰值為87℃±0.5℃. 表明本研究所采用的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性較好，擴(kuò)增效率較高，對細(xì)菌的特異性較強(qiáng).
本研究中Q-RT-PCR的線性監(jiān)測區(qū)間如下：大腸桿菌、 沙門氏菌和分枝桿菌均為1×102-1×109copies ?reaction-
1. 大腸桿菌與分枝桿菌的線性相關(guān)系數(shù)均>0.99，PCR擴(kuò)增效率在95%-115%之間.
采用培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR方法檢測水源地水樣消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌與分枝桿菌的濃度水平，檢測結(jié)果如圖 5所示. 從中可知，60 mJ ?cm-2劑量紫外消毒對可培養(yǎng)大腸桿菌及沙門氏菌的篩除率約為99.9%. 靳慧霞等人在研究紫外消毒對大腸桿菌滅活效率的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)消毒劑量為60 mJ ?cm-2時，大腸桿菌的去除率為99.99%[31]. 本研究相同劑量下，可培養(yǎng)大腸桿菌的去除率較低，這可能是由于紫外消毒會受到水體濁度、 有機(jī)物等的影響[32]. 但是，相同劑量的紫外消毒對可培養(yǎng)分枝桿菌的去除率不足90%，這與分枝桿菌特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān). 分枝桿菌的細(xì)胞膜富含脂類，細(xì)胞膜厚，具有疏水性，使得分枝桿菌對外界環(huán)境的抵抗性較強(qiáng)[33, 34].
qPCR檢測消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度水平的變化并不顯著. 這表明紫外消毒對細(xì)菌基因片段的破壞速率遠(yuǎn)小于其對細(xì)菌可培養(yǎng)性的破壞速率. qPCR檢測的是目標(biāo)(cause)菌的目的基因片段而不是整個基因組，由于檢測的目的基因的片段較短，無法很好地指示整個基因組的受損情況. Q-RT-PCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)60 mJ ?cm-2劑量紫外消毒后，活性大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度水平下降不顯著. 結(jié)合培養(yǎng)法的結(jié)果，細(xì)菌雖然無法在培養(yǎng)基上形成菌落，但是仍具有逆轉(zhuǎn)錄活性，這表明細(xì)菌仍具有一定活性. 這可能是由于經(jīng)過紫外照射后細(xì)菌可能進(jìn)入VBNC狀態(tài)，無法在培養(yǎng)基上生長，但仍具有細(xì)胞活性，可在一定條件下恢復(fù)其可培養(yǎng)性[35, 34]. 值得注意的是，分枝桿菌qPCR及Q-RT-PCR的檢測結(jié)果較培養(yǎng)法的檢測結(jié)果高2個數(shù)量級. 有學(xué)者指出，由于分枝桿菌種類較多，生長條件不同，一種培養(yǎng)基可能無法檢測到所有的分枝桿菌，采用qPCR的檢測結(jié)果會比培養(yǎng)法高1個多數(shù)量級[36]. 此外，Q-RT-PCR的檢測較qPCR略低，這是由于qPCR檢測到的是所有具有目的基因的DNA片段，而Q-RT-PCR檢測到的僅是具有逆轉(zhuǎn)錄活性的RNA片段，因此Q-RT-PCR比qPCR較好地指示污水中的活性病原菌的濃度水平.
圖 5 培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR對不同指示菌的檢測(檢查并測試)結(jié)果
上述研究結(jié)果表明，紫外消毒能夠抑制大腸桿菌及沙門氏菌的可培養(yǎng)性，但這些細(xì)菌尚能保持逆轉(zhuǎn)錄
